pkcβp66shc氧化应激通路对高氧诱导人肺泡上皮细胞凋亡的作用

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1、泸州医学院研究生硕士论文中图分类号：R89；R36；R39硕士学位论文PKCβ/p66Shc氧化应激通路对高氧诱导人肺泡上皮细胞凋亡的作用院（系）、所临床医学院研究生姓名车忠丽学科、专业儿科学(新生儿专业)导师姓名董文斌教授二Ο一三年四月1泸州医学院研究生硕士论文目录1PKCβ/p66Shc氧化应激通路对高氧诱导人肺泡上皮细胞凋亡的作用……………………………………………………………11.1中文摘要………………………………………………………11.2英文摘要………………………………………………………41.3前言……………………………

2、………………………………81.4材料与方法……………………………………………………101.5结果……………………………………………………………231.6讨论……………………………………………………………421.7结论……………………………………………………………441.8参考文献………………………………………………………451.9英汉缩略词对照表……………………………………………483活性氧（ROS)稳态和在细胞信号传导中的氧化还原调控作用(综述)………………………………………………………504攻读硕士学位期间发表和撰写的文……

3、…………………………………………………………642泸州医学院研究生硕士论文PKCβ/p66Shc氧化应激通路介导高氧诱导人肺泡上皮细胞凋亡的作用摘要目的：探讨PKCβ/p66Shc氧化应激通路介导高氧诱导人肺泡Ⅱ型上皮A549细胞凋亡的作用,探讨PKCβ抑制剂LY333531对高氧诱导肺泡上皮细胞的保护作用。方法：本实验是将体外传代培养的人肺泡Ⅱ型上皮A549细胞系（A549细胞)作为研究对象。以高体积分数氧（高氧）诱导人A549细胞模型为基础，以3L/min的速度通入含有95%氧气的高纯混合气处理细胞。将实验细胞A549随机分

4、为三组:对照组、高氧组，LY333531组。对照组：加入含有10%胎牛血清和1%青链霉素的DMEM高糖培养基中常规培养；高氧组：加入等量的上述培养液，换液后，通入3L/min的90%氧气和5%二氧化碳高纯混合气10min，在培养箱中密闭培养；LY333531组：用终浓度为10µmol/L的等量PKCβ特异性抑制剂LY333531的培养液预处理A549细胞24h后，再用高氧诱导A549细胞，10分钟后密闭培养。培养结束后收集细胞检测以下指标:倒置相差显微镜下观察A549细胞的形态学改变并照相；流式细胞术检测高氧及LY333531对

5、A549细胞凋亡率的影响；采用SP细胞免疫化学方法检测分组24h后PKCβ/Pin1/P66Shc/P66Shc-Ser36蛋白的表达;WesternBlot检测24h后PKCβ/Pin1/P66Shc/P66Shc-Ser36蛋白的表达;激光共聚焦显微镜检测分组24小时后P66Shc在线粒体内的转位;激1泸州医学院研究生硕士论文光共聚焦显微镜检测分组24小时后线粒体活性氧簇产生的情况;激光共聚焦显微镜检测分组24小时后线粒体膜电位的变化。结果：(1)倒置显微镜下，细胞生长状态良好，呈扁圆多角形，数量多，排列紧密，连接成片，悬浮

6、细胞较少。高氧组生长状态较差，细胞形态由典型的扁圆多角形细胞变成圆形或椭圆形，间隙增加，连接松散，活细胞数量明显降低，悬浮细胞数量明显增多。LY3333531组生长状态欠佳，活细胞数量较高氧组增多，悬浮细胞数较高氧组减少，但是未达到对照组的水平；(2)流式细胞术结果显示：高氧组与对照组相比，细胞凋亡率明显增加，差异有统计学意义（P<0.05）；而LY3333531组的凋亡率有所降低，与高氧组相比差异有统计学意义（P<0.05）;(3)免疫组化结果显示，与对照组相比，高氧组24h后A549细胞内PKCβ/Pin1/p66Shc/p

7、66Shc-Ser36蛋白表达均明显增加，差异有统计学意义（P<0.05）。与高氧组相比，LY3333531组Pin1/p66Shc/p66Shc-Ser36的表达明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）。(4)western-blot结果显示，与对照组相比，高氧组24小时后A549细胞内PKCβ/Pin1/p66Shc/p66Shc-Ser36蛋白表达均明显著增加，差异有显著性(P<0.05)。与高氧组相比，LY3333531组Pin1/p66Shc/p66Shc-Ser36的表达明显降低，差异有显著性(P<0.05)。(5

8、)激光共聚焦显微镜结果显示：与对照组相比，高氧组细胞p66Shc蛋白的转位率明显增加，差异有显著性(P<0.05)，与高氧组相比，LY3333531组转位率明显降低，差异有显著性(P<0.05)。(6)激光共聚焦显微镜结果显示：线粒体ROS呈红色荧光，细胞核呈蓝