rnai抑制ikkβ对人增生性瘢痕成纤维细胞作用地实验研究

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1、博士学位论文I汛Ai抑制IKKl3I对人增生性瘢痕成纤维细胞作用的实验研究博士研究生孙瑞霞指导教师柳大烈摘要皮肤创伤后病理性瘢痕的形成是临床面临的难题之一，目前缺乏有效的防治手段。增生性瘢痕的形成机制尚不清楚，一般认为，它是由于各种原因引起成纤维细胞异常增殖，胶原大量合成，导致细胞外基质中胶原过度沉积所致。现有的治疗增生性瘢痕的方法除手术外主要包括压迫、硅胶膜、皮质激素类药物注射、激光、冷冻、放射、IFN-Y，IFN-a2b等。但各种方法均存在效果不确切，易复发，药物治疗则需大剂量全身反复应用，不可避免地存在

2、对其它系统的损害，因而人们在不断地寻找方便而有效的方法。临床上对于瘢痕的防治，主要是通过阻断参与瘢痕组织形成过程中的细胞和细胞因子的作用，抑制细胞外基质的过度产生和积聚，具体包括下面几个方面：l、通过诱导程序性细胞死亡或凋亡，减少或去除参与瘢痕组织形成的细胞成分，或直接抑制这些细胞的生长和增殖；2、阻断对成纤维细胞合成胶原等细胞外基质成分有促进作用的阳性信号，或增强对成纤维细胞合成细胞外基质有抑制作用的阴性信号；3、抑制成纤维细胞基质前体合成的转录和翻译，以及已合成基质的聚合，或抑制与之有关的信号传导；4、增

3、强基质降解酶如胶原酶的活性，以去除已形成的纤维组织成分。核转录因子KB(NucleartranscriptionfactorofkappaB，NF—KB)是一类功能广泛的核转录调控元件，在细胞炎症反应、免疫反应以及细胞凋亡等过程中起着举足轻重的作用。细胞内NF-KB的活化信号都是通过不同的起始旁路汇聚于一条共同通道：即高分子寡聚蛋白IKK，IKK是丝氨酸特异性IKB中文摘要激酶。当细胞受到外界因素刺激(如创伤或病源微生物入侵)时，IKK被激活，IKB降解分离，NF-KB进入到细胞核，与DNA上特异性位点结合，

4、调控基因转录活化，诱导细胞合成各种生物大分子。随后，新合成的IKB又可与NF-KB结合返回胞浆中。IKK由三种亚基组成，其中IKKB是参与了促炎症因子诱导IKK的激活过程的重要亚基，IKK13的缺乏可以抑制NF-KB的激活，进而减少炎症的发生。炎症反应是创伤后的病理反应过程中的起始阶段，炎症反应的强弱对下一阶段的病理生理反应尤其皮肤瘢痕的形成有着决定性作用，炎症反应的强弱与编码炎症介质的基因表达强度有关，在调节这些炎症基因的转录因子中，NF．r,B的作用特别重要，是调节细胞炎症反应的许多基因的转录活化所必需，

5、NF—KB由多种信号途径激活后，进入细胞内，与炎症介质基因启动子区域结合，增加起转录效率。在急性炎症反应过程中，并控制着许多促炎症因子的表达，这些生物大分子包括了许多细胞因子如PDGF、TNF—Q、MMP、IL一1、IL一2等，这些因子既刺激成纤维细胞的移行、增殖，也刺激新生血管形成和细胞外基质合成、收缩。抑制NF．KB的活性可以下调其下游因子的基因表达，在对肝硬化、肺纤维化、皮肤瘢痕疙瘩等疾病的研究中发现抑制NF-KB的活性可以抑制成纤维细胞的增殖，减轻纤维化。本课题选取IKK13为靶点正是因为通过下调IK

6、K13以调控NF—KB这一关键因子，从而抑制术后炎症反应和细胞过度增殖，防止瘢痕组织形成。RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是由双链RNA(double--strandedRNA，dsRNA)分子介导的序列特异性转录后基因沉默过程，为双链RNA分子在mRNA水平上关闭相关基因表达的过程，是一项新兴的基因阻断技术。效应分子小片断干扰RNA(SmallorshortinterferingRNA，SiRNA)被证实在RNA干扰现象中起关键作用，在对哺乳动物细胞RNA干扰现象研究中发现，2卜23n

7、t长短及37末端2-4突出的siRNA能稳定、有效地抑制靶基因表达，为哺乳动物细胞RNA干扰研究提供新工具。由于RNA干扰具有特异性、高效性及多能性的优点，近lI博士学位论文年来已被广泛用于各种疾病的治疗。运用RNA干扰技术阻断肿瘤细胞的侵袭和转移也是一种好的肿瘤治疗方法。尽管特异性靶向是RNA干扰的显著优点，但是在运用这一方法时也会产生“瞬时”“脱靶"与“非特异性”现象：一个RNA干扰分子有可能因为基因序列的同源性而靶向一个以上的mRNA；某些siRNA会引起干扰素应答：选用病毒做载体往往会引起机体的免疫反

8、应。因此，人们需要更精确的设计、筛选RNA干扰分子，同时选用合适的载体。而在构建表达载体时经常使用U6启动子等RNA聚合酶IIIflE够识别的启动子序列最后将其转入到质粒中，构成特异性复合质粒，可取得稳定的转染效果。目的一．针对IKKD设计SiRNA引物，希望通过siRNA干扰沉默IKKB基因，下调NF．r．B这一关键因子，进而下调NF．1出通路各因子的表达水平，既抑制体内炎症反应、抑制成纤维细胞过