利用基因敲放技术建立胰岛β细胞特异表达的cre重组酶转基因小鼠模型

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1、第二军医大学硕士学位论文利用基因敲入技术建立胰岛B细胞特异表达的Cre重组酶转基因小鼠模型GenerationofisletBcell,specificCretransgenicmicebygenetargeting研究生姓名：李玲指导教师：章卫平教授导师组成员：张晔讲师学科、专业：病理学与病理生理学培养单位：基础医学部答辩日期：2013年5月第二军医大学(上海市)基础部病理生理学教研室独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表

2、或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。本人承担本声明的法律责任。学位论文作者签名：店≯日期：∥乡年局多日学位论文版权使用授权声明本人完全了解第二军医大学有关保留、使用学位论文的规定，第二军医大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权第二军医大学可以将学位论文全文或部分内容编入《中国学位论文全文数据库》、《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》等数据库进行检索。可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(

3、保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：彳矿日期：矽眵年伽弓日名／日巴移妻锄叫，签。议一】11]师辫导日目录中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯00010⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2缩略词表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3前言⋯．⋯⋯．⋯．⋯⋯⋯．．⋯⋯·⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4日U舌⋯“⋯⋯⋯一⋯⋯⋯”⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯斗第一部分Ins2．Cre打靶载体的构建⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯8一、材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

4、⋯⋯l0二、结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯16三、讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯24第二部分Ins．Cre转基因小鼠模型的建立与鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯26一、材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯26二、结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯35三、讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯42结{仑⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯44参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯45文献综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

5、⋯⋯⋯⋯49在读期间发表文章⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯61致谢⋯⋯⋯⋯·⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一62利用基因敲八技术建立胰岛D细胞特异性表达的Cre重组酶转基因小鼠模型摘要B细胞是体内胰岛素的主要来源，在维持血糖平衡中起着关键作用。B细胞不仅仅是分泌胰岛素的加工厂，而且还精细调节胰岛素的分泌，使血糖在较窄的范围内保持稳定。近年来，随着人们生活水平提高及生活方式的改变，2型糖尿病的发病率呈现逐年增加的趋势，进行性B细胞功能衰减直至B细胞功能衰竭是2型糖尿病发生发展的重要机制。对B细胞的研究也成

6、为了糖尿病药物治疗研究的主要方向。条件性基因打靶是在常规基因打靶的基础上，结合重组酶介导的位点特异性重组技术发展而来的一种基因打靶技术。它可以将对特定基因的修饰限制于特定类型的细胞、组织甚至小鼠发育的特定阶段。基于Cre／LoxP系统的条件基因打靶，通常借助同源重组将两个LoxP位点置于靶基因中编码重要功能域外显子的两侧内含子序列中，从而获得表型正常的Floxd,鼠；而后将该LoxP位点修饰的小鼠与细胞或组织特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠杂交后，可望获得组织特异性基因剔除小鼠。其中Cre重组酶只在特定的细胞或组织

7、中表达，并且Cre／LoxP位点依赖的重组会将该细胞中的靶基因剔除，而其它类型细胞中由于没有Cre重组酶的表达，靶基因不会被删除而仍然保持原有的表达模式。这样，就为我们研究某些删除后导致胚胎期致死的基因功能提供了很好的研究工具。基因敲除小鼠模型的应用为研究哺乳动物基因功能提供了可靠的方法。本研究以胰岛素2基因(Ins2)的第三个外显子为靶位点，利用新型的基于九噬菌体Red重组系统的重组工程技术，构建在胰腺B细胞中特异性表达Cre重组酶的基因敲入型打靶载体，为获得胰腺B细胞中基因特异性敲出小鼠模型提供关键材料。本研究以

8、低拷贝质粒pBR322为骨架构建取获载体(retrievingvector)，应用缺口修复(Gap．Repair)的方法在九噬菌体Red重组酶的作用下，通过同源重组亚克隆了长度约为12kbIns基因；同时构建一个带有内部核糖体进入位点(IRES)序列、Cre重组酶序列和正负向筛选标记基因的微型打靶载体(mini．targetingvector)