利用转基因毕赤酵母高表达重组人胰岛素

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1、北京化工大学硕士学位论文利用转基因毕赤酵母高表达重组人胰岛素姓名：李军申请学位级别：硕士专业：生物化工指导教师：陈劲春2003.5.10利用转基因毕赤酵母高表达重组人胰岛素摘要胰岛素是治疗I型糖尿病的必需药物，具有巨大的市场需求。毕赤酵母是一种可以以甲醇为唯一碳源的非常规酵母，近年来，发展成为蛋白高效表达体系。利用基因重组技术构建高效表达人胰岛素前体的毕赤酵母菌株，发酵生产人胰岛素具有重要意义。论文中，选用巴斯德毕赤酵母GSl15菌株为受体菌，分泌型质粒pPIC9k为载体，构建重组质粒pPIC9k／HIP，经线性化后，电击法转化巴斯德毕赤酵母。筛

2、选出his+Muf表型阳性克隆86株，在此基础上，进一步利用重组菌对G418抗性的差异筛选出了具有不同外源基因拷贝数的菌株，并成功表达了人胰岛素前体，而且各菌株的诱导表达水平与其拷贝数成正相关。获得了5—7个拷贝数的工程菌两株，，其诱导表达水平最高。／进一步研究了其表达模式，发现随着诱导时间t的延长，重组人胰岛素前体表达量也随之增加，72小时达高峰。在400mLBMGY培养基中进行诱导表达，发酵液经分离纯化以及蛋白质的加工获得了少量人胰岛素样品。利用免疫酶标法，10uL样品测得活性126．4uIU，证明具备人胰岛素活性。结果表明所设计的人胰岛素前

3、体基因在毕赤酵母中获得了正确的表达，表达的人胰岛素前体可以被正确的加工和折叠。这为进。步＼研究重组菌的发酵和表达创造了条件。^夕～关键词：人胰岛素前修巴斯德毕赤酵母，基因重组夕高拷黟生物活性、7HIGHEXPRESSl0N0FRECOMBINANTHUMANINSULINBYTRANSGENICYEASTP，(删B4SZ移尺巧ABSTRACTHumaninsulinisanindispensablemedicineforpatientswithIDDM(insulin—dependentdiabetesmellitus)inspiteofther

4、eareseveralcompoundswithsomebloodsugar-loweringeffect．Therefore，highexpressionoftherecombinanthumaninsulinisagreattarget，whichhasattractedmoreandmoreattentionfromtheresearchersaroundtheworldThemethylotrophicyeastPichiapastorisisarecentlydevelopedsystemforexpressingheterologou

5、sproteins．Ourpurposeistohighlyexpressthehumaninsulinbythissystem．Firstly,weselectedthesecretingplasmidpPIC9kasvectortoconstructrecombinantplasmidpPIC9k／HIPandyeastPichiapastorisGS15asthegene—expressionhost．Afterphysicalmappingandthenucleotidesequencingofthepurposegene，thereco

6、mbinantplasmidpPIC9k／HIPwaslineamizedbyrestrictionendonucleaseBglIIandtransformedintothehostGS15byelectroporation．TheG418(geneticin)resistancewasusedforscreeninghigh—copytransformantsfromthegainedhis+Muffphenotype86transformants．AfterfermentationOfthechosenstrains，thefermenta

7、tionsupernatewasdeterminedbyTricine。SDS-PAGE，whichindicat．edthetransgenicyeaststrainscouldhi曲lyexpressandsecretetheHIP．Moreover,itprovedthattheexpressionlevelincreasedwiththeincreasinggenecopyinrecombinantsTheexpressionquantityofonehigh—copystrainindicatedtheexpressingpro—ins

8、ulinincreasedwithtimecourseandreachedthemaximumexpressionafter72hour