lox-1在低氧诱导肺动脉高压肺血管重构中的作用及机制

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1、中图分类号UDCR96610博士学位论文学校代码!Q§三三密级公珏LOX．1在低氧诱导肺动脉高压肺血管重构中的作用及机制RoleofLOX一1inpulmonaryvascularremodelingof_●■'1l·●l■●hypoxiainducedpulmonaryarterialnVDertenSlonandtheunderlyingmechanisms作者姓名：学科专业：研究方向：学院(系、所)：指导教师：副指导教师：张卫芳药理学心血管药理学药学院胡长平论文答辩日期211三：』：>9答辩委员会主席中南大学二O一三年四月、原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行

2、的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。作者签名：远里茎日期：垒垒年』月立日学位论文版权使用授权书本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据

3、库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。作者签名：整兰茎导师签名——日期：丝堡年上月三Et第一章LOX．1介导低氧诱导肺动脉高压肺血管重构摘要【研究背景】肺动脉高压(pulmonaryarterialhypertension，PAl-I)表现为静息时平均肺动脉压大于25mmHg或运动时大于30mmHg，肺血管阻力大于3Wood单位。PAH的主要病因是肺小动脉原发病变而导致肺动脉阻力增加，最终可导致患者右心衰竭而死亡。业已证明，PAH时肺动脉阻力增高的主要原因是肺血管重构导致肺动脉腔隙狭窄，而肺动脉平滑肌细胞(pulmonaryarterialsmoothmusclecells，PASMC

4、s)的过度增殖是引起血管重构的关键因素。凝集素样氧化性低密度脂蛋白受体．1(1ectin．1ikeoxidizedlowdensitylipoproteinrecepter-1，LOX．1)在多种心血管疾病(包括动脉粥样硬化和高血压心血管重构)的发生与发展中起重要作用。LOX．1通过氧化应激和促炎机制损伤血管内皮细胞，促进心肌细胞和血管平滑肌细胞增殖从而介导心脏、胸主动脉和肾血管重构。最新研究发现，LOX．1在培养的慢性栓塞性肺动脉高压患者PASMCs中表达增加，可能介导C反应蛋白所诱导的PASMCs增殖。但LOX．1在低氧PAH血管重构中的作用及机制目前仍不清楚。因此，本研究拟在低氧诱

5、导的PAH大鼠模型及原代PASMCs模型，探讨LOX．1是否介导低氧诱导PAH肺血管重构，并进一步探讨该作用是否与其促PASMCs增殖有关。TT【方法】(1)在体实验：180-220gSD大鼠，采用低氧仓(10％02)饲养3周诱导低氧PAH大鼠模型。右颈外静脉插管测定右心室收缩压(IWSP)、平均肺动脉压(mPAP)。分离右心室(RV)、左心室加室间隔(LV+IS)并称重，计算RV／(LV+IS)比值。ELISA法检测大鼠血浆中sLOX．1水平；提取肺动脉总RNA或蛋白，real．timePCR或WesternBlot检测LOX．1、Ki．67、PCNAmRNA或蛋白表达；4％多聚甲醛固

6、定肺组织，石蜡包埋，进行HE染色或LOX．1免疫组化染色。(2)细胞实验：大鼠原代PASMCs采用组织块贴壁法制备，取第3代细胞进行oc．actin免疫组化鉴定细胞。3-6代用于后续实验。低氧(3％02)刺激细胞增殖。(3)LOX．1中和抗体实验：采用不同浓度LOX．1中和抗体(5、10、20ng／m1)预孵育1h，real．timePCR或WesternBlot检测LOX．1、Ki．67、PCNAmRNA或蛋白表达，流式细胞术检测细胞周期，MTS检测细胞增殖情况。(4)LOX．1小分子RNA干扰(si对悄)实验：当PASMCs达到60％---70％融合后，采用TurboFect转染试剂

7、将LOX-1siRNA干扰片段瞬时转入细胞，干扰LOX．1表达，real．timePCR或WestemBlot检测LOX．1mRNA或蛋白表达变化评价不同片段的干扰效率，选择最佳干扰片段及适当的浓度用于后续实验。LOX．1siRNA干扰24h后低氧处理细胞。Real．TimePCR或WesternBlot检测飚．67，PCNAmRNA或蛋白表达，流式细胞术检测细胞周期，MTS检测细胞增殖情况。【结果】1．低氧诱导PAH大鼠的RVSP