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时间:2019-03-04
《mir-34a通过抑制hmgb1调节视网膜母细胞瘤自噬及化疗效果的机制研究》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在学术论文-天天文库。
1、中图分类号UDC博士学位论文学校代码j够33miR一34a通过抑制HMGBl调节视网膜母细胞瘤自噬及化疗效果的机制研究miR--34aregulatesautophagyandchemotherapeuticresponseinretinoblastomacellsthroughrepressionofHMGBl作者姓名:刘可学科专业:临床医学研究方向:眼科学学院(系、所):湘雅二医院指导教师:段宣初教授论文答辩日期窒生兰:登答辩委员会主席中南大学二0一三年五月原创性声明本人声明,所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知,除了论文中特别加以标注和致谢的地方外
2、,论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。作者签名:}嗍丛年』月卑日学位论文版权使用授权书本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定,即:学校有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文,允许学位论文被查阅和借阅;学校可以公布学位论文的全部或部分内容,可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》,并通过网络向社会公众提供信息服务。作者签名:芈导师签名:日期:丛年£月芷Et博士学
3、位论文中文摘要摘要目的:探讨miR.34a能否通过HMGBl调控视网膜母细胞瘤细胞的凋亡及自噬,并增加DNA的损伤以提高化疗药物对视网膜母细胞瘤的治疗效果。方法:培养人视网膜母细胞瘤细胞Y79及Weft.RBl后分四部分完成本实验研究。1.miR-34a调节RB细胞HMGBl的表达:Y79及Weri.RB一1细胞转染miR一34amimic或antagomir-34a后,qRT-PCR及Westem-blotting分别检测HMGB1mRNA及蛋白表达水平改变,萤光素酶检测分析HMGB13'UTR报告基因活性改变。2.miR-34a通过调节HMGBl诱导凋亡并抑制自噬:Y79细胞转染miR-
4、34amimic、HMGBlshRNA或同时转染miR-34a和pUNO1-HMGB1cDNA72小时后Caspase3试剂盒及AnnexinV/FITC试剂盒检测细胞凋亡及Caspase3活性,Westem—blotting分析cleaved—cap3及cleavedPARP蛋白水平改变。Y79细胞转染miR-34amimic或HMGB1shRNA72小时后HBSS饥饿培养1小时,Western—blotting检测LC3、p62及HMGBl蛋白水平改变,免疫荧光观察并计数LC3点状聚集改变,透射电镜观察并计数自噬空泡数量改变。3.miR-34a通过抑制自噬增强RB细胞对化疗的敏感性:Y7
5、9细胞经长春新碱、依托泊苷或卡铂处理48小时后Western-blotting检测LC3及p62的蛋白水平。Y79细胞分别转染miR.34amimic、HMGBlTT博士学位论文中文摘要shRNA、BeclinshRNA及At95shRNA72小时后长春新碱、依托泊苷或卡铂处理48小时,计数LC3点状聚集数并检测细胞生存能力。4.miR-34a通过抑制自噬增加RB细胞化疗后DNA的损伤:Y79细胞分别转染miR-34amimic、HMGB1shRNA及At95shRNA后依托泊苷或卡铂处理48小时,Western.blotting检测),-H2AX蛋白水平,AnnexinV/FITC凋亡试剂
6、盒检测凋亡水平改变。在At95基因干扰的细胞加入NAC再经依托泊苷或卡铂处理48小时,Western—blotting观察1,-H2AX蛋白及凋亡水平改变。结果·Y79细胞和Weri.RBl细胞在转染miR-34amimic后HMGBl的mRNA水平、蛋白表达及3’UTR报告基因活性均下降,相反抑制miR.34a后HMGBl的mRNA水平、蛋白表达及3’UTR报告基因活性提高。转染mir-34amimic或HMGBlshRNA后,Y79细胞的凋亡水平及Caspase3活性均明显提高,反映蛋白裂解水平的cleavedCap3及cleavedPARP表达也增加。而通过转染pUNO1.HMGB1促
7、使HMGB1过表达可以抑制由miR.34amimic诱导的凋亡、Caspase3活性及cleavedPARP表达。HBSS饥饿培养Y79细胞后HMGBl的mRNA在1.2小时内增加,后逐渐下降至基线水平,而miR-34a一直处于增加状态。通过增加miR-34a或减少HMGBl能抑制由饥饿诱导的LC3II表达及LC3点状聚集,而使用溶酶体蛋白酶抑制剂E/P后可以恢复miR-34amimic转染细胞内的LC3II
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