同型半胱氨酸活化血管平滑肌细胞的新机制——内皮细胞中pdgfs的dna低甲基化及表达增加

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1、博士学位论文同型半胱氨酸活化血管平滑肌细胞的新机制——内皮细胞中PDGFs的DNA低甲基化题目及表达增加Anovelmechanismofvascularsmoothmusclecellactivationbyhomocycteine——DNAdemethylationandupregulationof英文题目PDGFsinendothelialcells姓名陈业群学号21020022所在学院汕头大学医学院导师姓名朱毅专业内科学入学日期2010-09答辩日期2013-06学位论文原创性声明本论文是我个人在导师指导下进行的工作研究及取得的研究成果。论文中除了特别加以标注和致谢的地方

2、外，不包含其他人或其它机构已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在论文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律责任由本人承担。作者签名：日期：年月日学位论文使用授权声明本人授权汕头大学保存本学位论文的电子和纸质文档，允许论文被查阅和借阅；学校可将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存和汇编论文；学校可以向国家有关部门或机构送交论文并授权其保存、借阅或上网公布本学位论文的全部或部分内容。对于保密的论文，按照保密的有关规定和程序处理。作者签名：导师签名：日期：年月日日期：年月日汕头大学医学院博士学位论文中

3、文摘要高同型半胱氨酸血症（Hypohomocysteinemia，HHcy）是动脉粥样硬化独立的危险因素。研究显示同型半胱氨酸（Homocysteine，Hcy）不仅通过调节周期蛋白A、抵抗素、蛋白酶C及胞外信号调节激酶-丝裂原活化蛋白激酶等途径激活平滑肌细胞（vascularsmoothmusclecell,VSMC），还可能通过血管内皮细胞（endothelialcell,EC）依赖性途径激活VSMC，但其机制尚不清楚。血小板衍生因子（Platelet-derivedgrowthfactors，PDGFs）是VSMC增殖与迁移的强刺激因子。PDGFs可通过自分泌及旁分泌方式调

4、节包括动脉粥样硬化、血管重朔、纤维化与血管再生等多种疾病的病理生理过程。研究显示Hcy可增加PDGF-BB对VSMC的促迁移作用。然而，Hcy对EC中PDGFs调节作用乃至EC与VSMC间的相互作用关系仍不明确。因此，本研究通过体内及体外实验研究Hcy是否通过上调EC中PDGFs进而调节VSMC的增殖与迁移。首先，我们采用不同浓度Hcy对单纯培养及与EC共培养的VSMC进行刺激，发现以500μMHcy刺激VSMC24小时才能增加VSMC的增殖与迁移，而当EC与VSMC共培养时，在100μM浓度时就能明显增加VSMC的增殖和迁移，且这种作用能明显被PDGFs受体拮抗剂所阻滞。同时实

5、时定量PCR及ELISA方法显示，Hcy能以浓度依赖性上调EC中PDGF-A、-C和-D的mRNA及蛋白水平，而不影响其它生长因子如血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子-2、转化生长因子-β1的表达。说明Hcy通过PDGFs介导EC-VSMC之间的相互作用。为研究Hcy对PDGFs的调控机制，我们采用生物信息学分析发现PDGFs启动子区存在丰富CpG岛，并在其中发现转录因子SP-1特异性结合位点。进一步实验研究显示Hcy及甲基化转移酶抑制剂5-aza-CdR和3-DZA均可使EC中PDGF-A、-C和-D启动子DNA甲基化水平下降，增加转录因子SP-1对该启动子

6、区结合活性，使PDGF-A、-C和-D表达升高；而用RNA干扰技术（siRNA）降低SP-1表达可减少EC中PDGF-A、-C及-D的表达及VSMC的迁移及增殖。同时我们发现Hcy减少EC中DNA甲基化转移酶1（DNAmethyltransferase1，DNMT1）的表达和活性，而且用siRNA干扰DMNT1表达能增加PDGF-A、-C和-D水平。说明Hcy通过抑制EC中DNMT1表达使DNA低甲基化及SP-1与启动子结合活性增加，引起PDGFs表达上调及分泌增加，进而激活VSMC。I汕头大学医学院博士学位论文为验证细胞实验的结果，我们分别用高蛋氨酸（2%）喂养C57BL/6J

7、小鼠4周或8周建立轻度和中度HHcy动物模型，其血清Hcy水平分别为27.6和61.5μmol/L，显著高于正常饮食对照组（5.2μmol/L）。甲基化特异性PCR结果显示小鼠胸主动脉内膜中PDGF-A、-C和-D基因启动子区DNA甲基化水平分别由86.0%、78.2%和73.2%下降到52.2%、36.7%和33.0%，而它们的mRNA及蛋白表达明显升高。同时，免疫荧光染色显示，HHcy小鼠胸主动脉VSMC增殖标志物增殖细胞核抗原（PCNA）及EC激活标志物血管细胞粘附因子-1