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《基因组dna甲基化在同型半胱氨酸致平滑肌细胞增殖的作用机制研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
1、基因组DNA甲基化在同型半胱氨酸致平滑肌细胞增殖的作用机制研究作者：姜怡邓马琳娜,韩学波王菊,徐支芳于海娇【摘要】目的探讨基因组DNA甲基化变化在Hcy致VSMCs增殖的作用机制。方法原代培养VSMCs并鉴定,用0、50、100、200、500μM浓度Hcy干预,MTT法检测VSMCs活性;SssI甲基转移酶法分析基因组DNA甲基接受能力,甲基化敏感性限制性内切酶法分析基因组DNA甲基接受能力及DNA甲基转移酶活性。结果MTT法表明在50μMHcy时,VSMCs活性明显增加,其余活性下降,与各浓度组并不呈量效
2、依赖关系;Hcy可增加DNA甲基接受能力,以50μMHcy组效应最显著(P<0.05);HpalI限制核酸内切酶消化,与对照组比较,基因组DNA甲基化接受能力减少了50.1%、41.7%、46.1%和25.5%(50、100、200、500μMHcy组),BssHII限制核酸内切酶消化后,基因组DNA甲基化接受能力减少了约25.5%、18.1%、17.4%和18.0%(50、100、200、500μMHcy组)。结论Hcy引起VSMCs基因组DNA去甲基化是平滑肌细胞增殖的重要机制之一,其效应偏重发生于
3、CpG二核苷酸序列,CpG岛所受影响相对较小,其最大效应在50μMHcy组,且无明显的量-效依赖关系。【关键词】同型半胱氨酸;平滑肌细胞增殖;基因组DNA甲基化12 动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)所致的心脑血管疾病是当今严重危害人类生命健康的疾病之一,其发病率和死亡率居各类疾病之首。循证医学证据表明[1-2],同型半胱氨酸(Homocysteine,Hcy)是AS形成的独立危险因子之一[3]。在AS的发生发展过程中,血管平滑肌细胞(vascularsmoothmusclecells,VS
4、MCs)的活化、增殖以及浸润功能的改变是AS形成的中心环节[4],国内外学者已对其展开了广泛的研究,但Hcy引起VSMCs增殖及其导致AS的发病机制尚未完全阐明。本文拟采用不同浓度Hcy干预原代培养的VSMCs,通过检测VSMCs基因组DNA甲基化的变化,旨在阐明基因组DNA甲基化在Hcy致VSMCs增殖中的作用机制,为预防和治疗AS提供一全新的视角。 1材料和方法 1.1药品和试剂 DEME/F12干粉状培养基购自Gibco公司;胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料研究所产品;胰酶、Hcy、L-多聚赖氨
5、酸(Poly-L-Lysine)、谷氨酰胺购自Sigma公司;poly[dI-dC].poly[dI-dC]、[methyl-3H]SAM、HpaIl、BssHIl、SssImethylase(CpG12methylase)均购自Sigma公司;鼠抗人平滑肌肌动蛋白单克隆抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司;即用型SABC免疫组化染色试剂盒、基因组DNA提取试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司;新鲜脐带取自银川市妇幼保健院。 1.2实验方法 1.2.1原代平滑肌细胞的培养和鉴定剖宫产术后的胎儿脐静脉,用D
6、-HanK's液(含100U·mL-1青霉素、100μg·mL-1链霉素),反复冲洗干净脐静脉,纵向剪开,棉签轻轻拭去内膜,将血管条剪成1mm×1mm的血管小块,用弯头吸管将血管小块移入培养瓶内,以3~5块/cm2密度均匀贴于培养甁底,培养甁内加入1~1.5mLDMEM/F12培养液,置37℃、5%CO2孵箱培养,每3天换液1次,待细胞融合成片时,即可传代。人脐静脉VSMCs经相差显微镜及α-actin免疫组织化学鉴定,取第3~5代用于实验研究。 1.2.2实验分组 实验共分为5组,分别含0、50、100
7、、200、500μmol·L-1Hcy的完全培养基孵育细胞,每组6孔细胞。 1.2.3MTT法检测VSMCs的增殖活性12 用0.25%胰蛋白酶消化单层平滑肌细胞,用含10%胎牛血清的培养液DEME/F12配成单个细胞悬液,以每孔103~104个细胞接种于96孔培养板中,每孔体积200μL。培养3~5d后,每孔加入MTT溶液(5mg·mL-1)20μL,37℃继续孵育4h,终止培养,离心(1000rpm,5min),然后弃去孔内培养液,每孔加入150μLDMSO,振荡10min,充分溶解。选择490nm波
8、长,在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值,记录结果。 1.2.4SssI甲基转移酶法分析基因组DNA甲基接受能力按照试剂盒操作抽提DNA,DNA的甲基接受能力可间接反应基因组甲基化的水平，甲基接受能力高表明基因组原有的甲基化水平低，反之则甲基化水平高。利用细菌SssI甲基转移酶催化DNA的CpG位点发生甲基化，3H标记的S-腺苷甲硫氨酸(3H-SAM)为甲基供体，测到的放射性强度即为DNA甲基接受能
