ec-sod dna甲基化在高同型半胱氨酸血症致apoe--鼠动脉粥样硬化中的作用及调控机制研究

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1、分类号：R4单位代码：10752密级：公开学号：2010147宁夏医科大学硕士研究生学位论文EC-SODDNA甲基化在高同型半胱氨酸血症致-/-ApoE鼠动脉粥样硬化中的作用及调控机制研究TheMechanismofEC-SODDNAMethylationinHyperhomocysteinemia-induced-/-AtherosclerosisinApoEMice学位申请人：孙炜炜指导教师：姜怡邓副教授申请学位门类级别：医学专业名称：临床检验诊断学研究方向：动脉粥样硬化的分子生物学诊断所在学院：检验学院论文完成日期：二〇一三年四月宁

2、夏医科大学研究生院NingxiaMedicalUniversityThesisforApplicationofMaster’sDegreeTheMechanismofEC-SODDNAMethylationinHyperhomocysteinemia-inducedAtherosclerosisin-/-ApoEMiceStudent’sName:SunWeiweiSupervisor：JiangYidengSubjectCategory:MedicineMajor:ClinicalLaboratoryDiagnosticsSpecial

3、ty:MolecularBiologicalDiagnosisofAtherosclerosisSchool:InsituteofLaboratoryMedicineCompletionDate:Apr.2013宁夏医科大学学位论文独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是个人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果，无抄袭及编造行为。除文中已经特别加以注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明并致谢。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承

4、担。论文作者签名＿＿＿＿＿论文导师签名＿＿＿＿＿年月日年月日宁夏医科大学关于学位论文使用授权的声明宁夏医科大学有权保留使用本人学位论文，同意学校按规定向国家有关部门机构送交论文的复印件和电子版，允许被查阅和借阅。本人授权宁夏医科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复印手段保存和汇编本学位论文。可以公布（包括刊登）论文的全部或部分内容。（保密论文在解密后应遵守此规定）论文作者签名＿＿＿＿＿论文导师签名＿＿＿＿＿年月日年月宁夏医科大学硕士研究生学位论文中文摘要-/-EC-SODDNA甲基化在高同

5、型半胱氨酸血症致ApoE鼠动脉粥样硬化中的作用及调控机制研究摘要目的研究EC-SODDNA甲基化水平改变在高同型半胱氨酸血症(Hyperhomo--/-cysteinemia,HHcy)致ApoE小鼠动脉动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)中的作用，并在THP-1单核细胞源性巨噬细胞水平上进一步探讨同型半胱氨酸(Homocysteine,Hcy)调控EC-SODDNA甲基化水平改变的机制，明确Hcy对EC-SOD甲基化的作用及其调控机制，寻找Hcy引起EC-SOD甲基化改变的关键靶点，为预防和治疗HHcy引起的AS提供新的

6、理论和实验依据。-/-方法1.选择36只SPF级近交系C57BL/6J背景5周龄雄性纯合子ApoE鼠，随机平均-/-分为ApoE鼠对照组，HHcy组和干预组，另选12只健康5周龄SPF级近交系C57BL/6J雄性小鼠喂食普通饲料作为正常对照组。喂养14周后，各组小鼠腹腔注射20%乌拉坦麻醉，摘除眼球取血分离血清，全自动生化分析仪测定血清Hcy和血脂水平；取主动脉进行石蜡包埋，切片，HE染色；分光光度比色法测定各组主动脉中总抗氧化能力(T-AOC)、超-氧阴离子自由基(O2·)、羟基自由基(OH·)、过氧化氢(H2O2)、丙二醛(MDA)含

7、量的变化；采用实时荧光定量PCR(real-timePCR)法检测各组主动脉中细胞外超氧化物歧化酶(EC-SOD)和DNA甲基转移酶1(DNMT1)mRNA的表达；免疫荧光法检测各组主动脉中EC-SOD蛋白的表达；巢式降落式甲基化特异性PCR(ntMS-PCR)法检测EC-SODDNA甲基化的改变；高效液相色谱法(HPLC)检测主动脉中S-腺苷甲硫氨酸(SAM)和S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)的浓度。622.体外培养THP-1单核细胞，以4×10个接种于25cm细胞培养瓶中，加入含500nmol/L佛波酯(PMA)的R/MINI-1640

8、培养液5mL，于37℃5%CO2培养箱中培养48h后，显微镜下观察此时细胞呈贴壁状态，细胞形态不规则且有伪足伸出，证实THP-1单核细胞已经分化为巨噬细胞。构建pEGFP-N1-DNMT1重组