高同型半胱氨酸血症抑制血管再生的机制研究

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1、学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得直昌大堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名(手写)：√暨傻签字日期：，三年多月吕日学位论文作者签名(手写)：讯签字日期：，三年多月吕日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解南昌大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，

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3、流行病学调查表明高同型半胱氨酸血症与心血管疾病发病率密切相关。Meta分析也发现血清同型半胱氨酸(Hcy)每增加5“mol／L，罹患心血管疾病风险增加1．6．1．8倍。HHcy可以抑制内皮细胞生长和内皮损伤后的再内皮化，损害内皮的舒张功能，并能加速血管内膜的增生，同时促进平滑肌细胞增生。我们知道，在各种病理状态下，血管再生的过程都参与其中。血管再生是一种不同于血管发育的，在病理条件下受严格调控的血管生成，但Hcy如何影响血管再生的机制并不清楚。本课题我们研究高同型半胱氨酸血症对血管再生的影响及机制。第一部分：高同型半胱氨酸抑制血管再生目的：运用多种经典血管再生模型

4、观察高同型半胱氨酸血症对血管再生的影响。方法：1、选用转基因Tg．hCBS+Cbs州八士小鼠(Kruger实验室，费城，宾夕法尼亚)，由于其胱硫醚p合成酶(CBS，cystathionine．13．synthase)缺乏，致使同型半胱氨酸代谢中转硫基途径受阻，血清同型半胱氨酸水平白发上升，一般可达到重度高同型半胱氨酸血症(血清同型半胱氨酸>1151xmol／L)。乳鼠出生10日之内进行基因测定。2、运用多种经典血管再生模型，观察小鼠血管再生。2．1眼球视网膜血管染色：选取出生后1天，3天，7天，14天乳鼠及8．12周成年雄性小鼠，处死后摘取眼球，分离视网膜，免疫荧

5、光染色视网膜血管内皮细胞(IsolectinB4染色)，激光共聚焦显微镜下逐层扫描，重组3D图像，每个样本选取3个层面计数视网膜血管网长度总和，比较对照组与高同型半胱氨酸血症小鼠视网膜血管密度及长度。2．2主动脉环微血管生成(Aorticringassay)。分离小鼠主动脉(长约lOmm)，清理干净周围脂肪组织及血液，切成多个约lmm长度血管环，种植于基质胶(Matrigel)上，每日拍照并计数微血管生长。11摘要结果：1、高同型半胱氨酸血症抑制乳鼠的视网膜血管的生长，同时成年小鼠的视网膜血管网血管再生也受到抑制(p<0．05)。2、高同型半胱氨酸抑SO,J,鼠主

6、动脉环微血管生成。在主动脉环接种于基质胶的第5天，可以观察到高同型半胱氨酸血症组(hCBS+Cbs乒小鼠)的主动脉环微血管生成受抑制。主动脉环微血管生成同时呈现了同型半胱氨酸浓度依赖性，随着浓度升高，微血管生长抑制加强。结论：高同型半胱氨酸血症小鼠血管再生受抑制。关键词：高同型半胱氨酸，视网膜血管网，胱硫醚p合成酶，转硫基途径，血管再生第二部分：高同型半胱氨酸血症致使肝细胞生长因子(HGF)释放减少从而抑制血管再生目的：探讨高同型半胱氨酸抑制血管再生的分子机制方法：l、小管形成(Tubeformation)。选取人主动脉内皮细胞(HAEC)以及人微小血管内皮细胞(

7、HMVEC．C)，传代至第8代后，分别使用不同浓度DL．Hcy(100／200／500I_tm)处理细胞24小时。基质胶(Matrigel)预先铺板(96孔板)，胰酶消化细胞后，种植于基质胶(Matrigel)上，8小时后观察小管形成情况，计数小管形成个数及长度；2、血管再生基因RT2profilerTMPCR筛查。此PCR基因筛查试剂盒包含血管再生过程中的84个主要基因，其中包括生长因子及其受体，趋化因子和细胞因子，粘附因子，蛋白酶以及抑制剂和转录因子等。提取来自对照组以及Hcy处理组的人主动脉内皮细胞(HAEC)总RNA，Real．timePCR检测基因表达，

8、确定有意义