半滑舌鳎生长轴关键基因的重组表达及对生长与生殖的调控机制研究

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1、学校代码：10264研究生学号：M100101008上海海洋大学硕士学位论文半滑舌鳎生长轴关键基因的重组表达及对生长与题目：生殖的调控机制研究StudiesonkeygenesalonggrowaxisfromCynoglossus英文题目：semilaevisGünther:invitrorecombinantexpressionandrolesingrowthandreproductionregulation专业：水产养殖研究方向：鱼类生长内分泌调控机制研究姓名：刘芝亮指导教师：柳学周研究院二O一三年四月六日上海海洋大学硕士学位论文上海海洋大学学位论

2、文原创性声明本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日上海海洋大学学位论文版权使用授权书学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海海洋大学可以将本学位论文的全部或部分内容编

3、入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在年解密后适用本版权书。本学位论文属于不保密□学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日上海海洋大学硕士学位论文上海海洋大学硕士学位论文答辩委员会成员名单姓名工作单位职称备注温海深中国海洋大学教授主席宋协法中国海洋大学教授委员邢婧中国海洋大学教授委员郭文山东省海水养殖研究所研究员委员刘鹰中科院海洋研究所研究员委员廖梅杰黄海水产研究所副研究员秘书答辩地黄海所一号楼三楼会议答辩日期2013.5.25点室上海海洋大学硕士学位论文半滑舌鳎生长轴关键基因的重组表达及

4、对生长与生殖的调控机制研究摘要本文以我国鲆鲽类主导养殖品种—半滑舌鳎（CynoglossussemilaevisGünther）为研究对象，运用分子克隆、原核表达和Westernblotting等技术手段成功构建了半滑舌鳎GH、IGF-I和IGF-II体外原核表达系统，得到了纯化的具有生物活性的体外重组蛋白；通过腹腔注射诱导的方法验证了外源重组牛GH蛋白和重组半滑舌鳎IGF-I蛋白对半滑舌鳎的促生长作用，从血清GH和IGF-I表达水平、消化酶活力等角度探讨了这种促生长作用的机制；最后，组合运用组织切片、酶联免疫吸附测定（ELISA）和荧光实时定量PCR等

5、方法研究了GH和IGF-I在半滑舌鳎生殖周期中的表达特性和可能的调控作用机制，为深入认识半滑舌鳎生殖调控机制提供了理论支撑。本研究结果为全面揭示半滑舌鳎生长轴在生长和生殖中的调控作用提供了更为丰富的基础资料相关结果如下：1.半滑舌鳎GH、IGF-I和IGF-II的原核表达和活性分析根据半滑舌鳎类胰岛素生长因子-Ⅰ和Ⅱ的cDNA全长序列，分析并设计引物克隆得到编码IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ成熟肽序列，其成熟肽序列均由210个碱基组成，编码70个氨基酸，包括B-C-A-D四个功能域。I上海海洋大学硕士学位论文利用PCR方法将扩增片段克隆到原核表达载体pET-28

6、a上，得到重组质粒，将重组质粒导入到大肠杆菌BL21(DE3)后经IPTG诱导产生N端含6个组氨酸的融合蛋白。以SDS-PAGE电泳检测和SigmaScan软件分析获得的蛋白，结果表明：IGF-Ⅰ融合蛋白大小为11.4KD，在37℃条件下IPTG诱导3h时目的蛋白表达量最高，占细菌总蛋白的58.5%，融合蛋白主要以包涵体形式存在。IGF-Ⅱ融合蛋白大小也为11.4KD，在IPTG诱导2h时目的蛋白表达量最高，占细菌总蛋白的43.7%。利用Westernblotting方法验证这两种融合蛋白均可特异性的被6×His抗2+体识别。诱导表达蛋白后的菌液沉淀经6

7、mol/L盐酸胍变性、Ni离子亲和柱纯化和尿素梯度复性，获得大小为11.4KD的纯化蛋白。细胞增殖实验表明，本研究所得IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ融合蛋白能显著促进人乳腺癌细胞MDA231细胞的增殖，具有明显的生物学活性。根据半滑舌鳎生长激素（GH）基因的cDNA全长序列，分析并设计引物克隆得到编码GH的成熟肽序列，此序列由552个碱基组成。利用PCR方法将扩增片段克隆到原核表达载体pET-28a上，得到重组质粒，将重组质粒导入到大肠杆菌BL21(DE3)后经IPTG诱导产生N端含6个组氨酸的融合蛋白。SDS-PAGE电泳检测和SigmaScan软件分析表明：

8、GH融合蛋白大小为26KD，在IPTG诱导4h时目的蛋白表达量最高，占细菌总蛋白