古井窖泥微生物群落纲层级定量识别的引物设计和应用

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1、硕士学位论文古井窖泥微生物群落纲层级定量识别的引物设计和应用DEVELOPMENTANDAPPLICATIONOFCLASSTAXONOMY-SPECIFICPRIMERSFORQUANTITATIVEDETECTINGOFMICROFLORASTRUCTUREINGUJINGPITMUDSAMPLES高志磊哈尔滨工业大学2015年6月国内图书分类号：R151.2学校代码：10213国际图书分类号：570密级：公开理学硕士学位论文古井窖泥微生物群落纲层级定量识别的引物设计和应用硕士研究生：高志磊导师：张治洲教授申请学位：理学硕士学科：海洋科学所在单位：

2、海洋科学与技术学院答辩日期：2015年6月授予学位单位：哈尔滨工业大学ClassifiedIndex:R151.2U.D.C:570DissertationfortheMasterDegreeinScienceDEVELOPMENTANDAPPLICATIONOFCLASSTAXONOMY-SPECIFICPRIMERSFORQUANTITATIVEDETECTINGOFMICROFLORASTRUCTUREINGUJINGPITMUDSAMPLESCandidate：GaoZhileiSupervisor：Prof.ZhangZhizhouAcade

3、micDegreeAppliedfor：MasterofScienceSpeciality：MarineScienceAffiliation：SchoolofMarineScienceandTechnologyDateofDefence：June,2015Degree-Conferring-Institution：HarbinInstituteofTechnology哈尔滨工业大学理学硕士学位论文摘要古井窖泥中含有丰富的微生物群落，在酿制独特风味白酒的过程中起到了关键作用，而对窖泥中微生物群落结构的解析，目前既有的研究尚欠深入。本课题借助于古井窖泥16

4、SrRNA基因序列分析其微生物群落多样性的特征，搜索分类层级上的SNP(SingleNucleotidePolymorphisms)位点，判断设计引物所在的最佳分类层级，在此基础上设计纲特异性引物，实现在纲分类层级上对古井窖泥中微生物群落结构的定量识别。微生物群落的多样性与环境因素息息相关，不同环境下的微生物种群结构可能差异很大。古井窖泥中的微生物的种类和白酒的风味密切相关，Clostridia纲作为主要的产香菌在窖泥中的含量最高，进化树分析表明该纲16S序列复杂性最高，而且与其他的几个纲交织在一起在进化树上无法分开，可能是与其它纲微生物共生的缘故。对

5、290条高质量16S序列的多样性指数分析表明这些序列包含的信息足够反映出窖泥中真实的情况。通过对古井窖泥高质量16S序列进行Mafft多序列比对分析，选择分类层级特异性的SNP位点，继而应用SAP（SimpleAllele-discriminatingPCR）引物设计原理和一般的引物设计规则，共设计出10对纲特异性引物，检测并筛选具有良好特异性的引物。对特异性较差的纲引物进行调整实验条件或设计新引物，最终确定了8对特异性高的纲引物，同时也确定了各个纲引物具体的PCR及qPCR反应条件。通过不同混合比例的模板对8对特异性引物进一步检测和筛选，目的是筛选出

6、能用于准确定量的纲特异性引物，结果发现除了Betaproteobacteria纲外，其余的7对引物均对不同浓度的模板具有高度的灵敏性。随后将其分别用于窖泥宏基因组的定量分析，实验结果表明除了Alphaproteobacteria纲之外的6对纲特异性引物具有准确的定量性质，可以得到各个的纲组成和含量等精确信息。最终确定的6对纲特异性引物分别针对Actinobacteria、Gammaproteobacteria、Bacteroidia、Mollicutes、Bacilli、Synergistia等纲。本研究不仅对不同窖泥样本的纲含量进行定量分析，而且发现

7、窖泥的池壁比池底的微生物种群更丰富。这项技术对于快速定量研究其它未知微生物群落和动态监测酿酒过程中窖泥微生物群落的变化具有重要的意义。T关键词：T微生物群落；窖泥；纲特异性引物；实时荧光定量PCR-I-哈尔滨工业大学理学硕士学位论文AbstractAbundantmicrobialpopulationsintheGujingpitmudplayakeyroleintheprocessoffermentinguniqueflavorliquor,butmorecomprehensivestudiesareneededtodecipherandquanti

8、fymicrobialpopulationsinthepitmud.Thisthesistak