db34t 2560-2015 窖泥微生物群落结构快速定量测定 psp-qpcr绝对定量法

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1、ICS01.040.67X60DB34安徽省地方标准DB34/T2560—2015窖泥微生物群落结构快速定量测定PSP-qPCR绝对定量法QuicklydetectionmethedtoquantifypitsmudmicrobialcommunitiesPSP-absoluteqPCRmethod文稿版次选择2015-12-30发布2016-01-30实施安徽省质量技术监督局发布DB34/T2560—2015前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由安徽省浓香型白酒标准化技术委员会提出并归口。本标准起草单位：安徽瑞思威尔科技有限

2、公司、安徽古井贡酒股份有限公司、哈尔滨工业大学。本标准起草人：何宏魁、周庆伍、李安军、刘国英、余秀娟、汤有宏、葛向阳、张会敏、蒋军、聂加燕。IDB34/T2560—2015窖泥微生物群落结构快速定量测定PSP-qPCR绝对定量法1范围本标准规定了一种基于门特异性引物测定窖泥微生物群落结构组成的快速定量优化方法。本标准适用于窖泥中微生物群落结构的快速定量检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实

3、验室用水规格和试验方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1门特异性引物phylum-specificprimers，PSP指特异性扩增某个门的所有微生物基因序列所共有且相对于其余门的微生物基因序列所独有的基因序列的引物对，由一条正向引物（5’→3’）和一条反向引物（3’→5’)组成。3.2荧光定量PCRquantitativePCR，qPCR又称real-timePCR，荧光反转录-聚合酶链反应。3.3Ct值cyclethresholdvalue指PCR反应体系中目标DNA浓度达到人为确定的阈值时的PCR循环次数。3.4TA克隆TAClon

4、e是一种亚克隆方式，在连接酶存在的情况下，依赖DNA链两端的腺嘌呤（A）和胸腺嘧啶（T）的互补作用，将不同DNA链连接。4原理1DB34/T2560—2015实时荧光PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监控整个PCR过程。将标记有荧光素的Taqman探针与模板DNA混合后，完成高温变性，低温复性，适温延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应规律，与模板DNA互补配对的Taqman探针被切断，荧光素游离于反应体系中，在特定光激发下发出荧光，随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化

5、荧光信号强度，求得Ct值，进而根据未知样品的Ct值在标准曲线的位置得到未知样品中目标序列的初始拷贝浓度的方法。采用SAP技术（单碱基差异原则）设计门特异性引物，在引物的3’端为单核苷酸多态性位点，当在引物3’末端倒数第二个碱基引入错配后，若最后一个碱基是强配对碱基，则此种情况下引物仍可以与模板配对并延伸。5试剂和材料5.1本标准中所用的水，除文中提到的ddH2O属于经过两次蒸馏的双蒸水以外，其他实验室用水均指符合GB/T6682中要求的三级水。所述溶液，在未特别注明，均指水溶液。5.2土壤基因组DNA提取试剂盒。5.3胶回收试剂盒。注：胶回收试剂盒是

6、由相关试剂公司提供，可用不同公司的等效产品具有相同效果即可。5.4TA克隆试剂盒。注：TA克隆试剂盒是由相关试剂公司提供，可用不同公司的等效产品具有相同效果即可。5.5大肠杆菌感受态细胞。注：大肠杆菌感受态细胞是由相关试剂公司提供，可用不同公司的等效产品具有相同效果即可。5.6PCR试剂盒。5.7qPCR试剂盒。5.8质粒DNA提取试剂盒。5.9细菌16SrDNA扩增引物。注：第4章中所述主要试剂提及几种试剂盒和试剂，由于不同品牌的试剂盒中试剂和操作步骤略有差异，根据各种试剂盒实际使用效果，为方便本标准的使用者，现对部分试剂盒给予常用供应商标注，供标

7、准使用者参考。6仪器和设备6.1紫外核酸检测仪。6.2荧光定量PCR仪。6.3PCR仪。6.4凝胶成像系统。6.5高速冷冻离心机。6.6冰盒。6.7移液枪。6.8八连管离心机。7测定步骤7.1门特异性引物设计2DB34/T2560—20157.1.1样品总DNA的提取、细菌16SrDNA的PCR扩增、克隆文库的构建及阳性克隆的筛选提取窖泥样品中的基因组总DNA（按5.2说明书的方法），以此为模板扩增接近全长的16SrDNA。1选择扩增引物，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，将指定片段的条带切胶回收纯化（按5.3说明书的方法），然后进行TA克隆（按5.4说明书

8、的方法），连接产物进行转化（按5.5说明书方法），后进行蓝白2斑筛选，获得一定数目的有效克隆。注1：扩增引物