中华绒螯蟹(eriochier sinensis)血细胞组成、功能及体外培养的研究

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1、学校代码：10264研究生学号：M100101055上海海洋大学硕士学位论文中华绒螯蟹(Eriochiersinensis)血细胞组成、题目：功能及体外培养的研究Theresearchoncomponent,functionandin英文题目：vitrocultureofhemocytesfromthemittencrab,Eriochiersinensis专业：水产养殖研究方向：甲壳动物生理与免疫姓名：洪宇航指导教师：杨筱珍二O一三年六月十七日上海海洋大学硕士学位论文答辩委员会成员名单姓名工作单位职称备注答辩地点答

2、辩日期上海海洋大学硕士学位论文上海海洋大学学位论文原创性声明本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日上海海洋大学学位论文版权使用授权书学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件

3、和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海海洋大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在年解密后适用本版权书。本学位论文属于不保密□学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日I上海海洋大学硕士学位论文中华绒螯蟹（Eriocheirsinensis）血细胞组成、功能及体外培养的研究摘要作为细胞免疫的承担者和体液免疫相关免疫因子的提供者，血细胞在甲壳动物非特异性免疫中有着重要的作用，包括吞噬、包囊、黑化、细胞毒性、胞间信息

4、传递以及酚氧化酶原系统的激活等。本研究选取在我国具有较高经济价值的主要淡水养殖品种中华绒螯蟹（Eriocheirsinensis）作为研究对象，通过对其血细胞进行多种细胞学染色和免疫相关酶染色，并测定其在嗜水气单胞菌注射后血淋巴中总血细胞数（THC）和不同血细胞比例（DHC）的变化，研究其血细胞种类、各类型比例，以及在免疫应答过程中各类型细胞比例的变化；通过对血细胞在不同培养基、血清、pH、温度和渗透压条件下进行离体培养，确定了最佳的培养条件；对各类型血细胞进行了分离培养。这些研究为今后血细胞的发生、免疫机制以及建立

5、细胞系的研究提供了基础资料，研究结果如下：1.通过对中华绒螯蟹血细胞进行细胞学染色和免疫相关酶染色分析，将中华绒螯蟹血细胞分为四类：大颗粒细胞（Granulocyte，G）、中间型颗粒细胞（IntermediateGranulocyte，IG）、小颗粒细胞（Semigranulocyte，SG）和透明细胞（Hyalinocyte，H）。四种细胞中，大颗粒细胞体型最大，同中间型细胞一样含有嗜酸性颗粒；小颗粒细胞数量最多，含有大量嗜碱性颗粒；而透明细胞体型最小，基本不含任何颗粒物质。四种细胞中均含有多糖成分而不含脂类物质

6、；只有大颗粒细胞在四种水解或氧化酶检测中显示阳性反应。通过体外注射嗜水气单胞菌，9中华绒螯蟹血淋巴THC发生不同程度变化。其中注射组(注射浓度1×10CFU/ml嗜水气单胞菌100μl)较生理盐水组（注射蟹生理盐水100μl）变化更明显，在6hTHC达到最大值，显著高于其余两组（P＜0.05）,然后逐渐降低到接近正常水平。而注射组的DHC检测结果显示：透明细胞数量在注射后3h大幅度增加，6h后达到最大值，比最初增加了接近一倍，然后有所回落；小颗粒细胞数量基本保持不变；而其他各类型细胞数量均有不同程度下降，其中大颗粒细

7、胞数量持续下降，在12h降至最低，相比正常值降低了约一倍，然后有所回升。本研究证实，不同类型中华绒螯蟹血细胞有着不同的结构与功能。其中，大颗粒细胞有较高的酶活性而透明细胞有较强的直接抗病菌作用，他们在免疫应答过程中共同作用来抵御病原物II上海海洋大学硕士学位论文质的入侵。2.比较了几种常见血细胞培养基（L-15、2×L-15、3×L-15、M199和RMPI-1640）对中华绒螯蟹血细胞离体培养中细胞形态以及存活率的影响，以及在筛选获得的最佳培养基中添加不同比例胎牛血清(FBS)(0%、5%、10%和15%)，进一步

8、观察了血清对中华绒螯蟹血细胞培养效果的比较。结果表明，3×L-15培养基培养效果较好，所培养的细胞形态相对完整，数量较多，培养至96h时血细胞存活率仍大于60%;而其他4种培养基效果较差，培养12h存活率均低于50%，且细胞形态结构变化明显。以3×L-15培养基为基础，添加不同比例胎牛血清后发现，对细胞存活有显著影响，存活率明显降低。因此，不添