家兔促卵泡激素β(fshβ)基因克隆及表达研究

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1、家兔促卵泡激素p(FSHl3)基因克隆及表达研究CloningandExpressionAnalysisofRabbitFollicle—·StimulatingHormonep(FSH131)gene研究生：石福岳导师：吴信生教授专业：动物遗传育种与繁殖国家兔产业技术体系专项(CARS．44．1)、江苏省高新技术项目(BG2007325)资助SupportedbytheearmarkedfundforChinaAgricultureResearchSystem(Grantno．CARS一44-1)，JiangsuHighTechnologyProject(Gra

2、ntno．BG2007325)扬州大学动物科学与技术学院2013年5月石福岳家兔促卵泡激素13(FSHl3)基因克隆及表达研究家兔促卵泡激素13I(FSHl3)基因克隆及表达研究研究生t石福岳导师：吴信生教授专业：动物遗传育种与繁殖(扬州大学动物科学与技术学院，江苏扬州，225009)中文摘要促卵泡激素是由动物垂体前叶嗜碱性细胞合成并分泌的一种糖蛋白激素，由a和13亚基组成，而p亚基是激素生物活性和免疫活性的决定因素。促卵泡激素B亚单位由FSHl3基因编码，前人的研究表明，FSHB基因多态性与动物多产性有密切关联性，该基因是影响动物产仔数的主效基因之一。本研究以新

3、西兰白兔为研究对象，采用基因克隆、原核表达和Real．timePCR等方法研究家兔FSHl3基因的在原核表达系统中的表达情况，制备抗家兔FSHl3多克隆抗体，并对FSHl3基因在家兔卵巢、输卵管、子宫、睾丸和输精管等生殖器官中的表达差异进行了分析。主要结果如下：1．本研究参考GenBank数据库中日本大耳兔FSHl3基因的mRNA序列设计了一对引物，对新西兰白兔FSHl3基因进行克隆、序列分析，并将其与其它物种的FSHIB基因CDS序列和编码氨基酸序列进行同源性比较。结果表明，克隆得到的CDS序列与GenBank数据库中的序列完全一致，核苷酸序列与其它哺乳动物的同

4、源性较高(86．4％89．7％)，但与禽类、鱼类的同源性较低，分别为74．1％和53．3％。基于FSHl3基因序列进行系统进化分析，可知家兔与人、黑猩猩的亲缘关系较近，聚类分析结果与生物学分类结果基本一致。2．PCR扩增FSHl3基因去信号肽序列，并成功构建了去信号肽FSHl3基因的原核表达载体pGEX-4T-1．FSHl3，经IPTG诱导表达、超声波破碎菌体、SDS．PAGE凝胶电泳检测，得到大小约为42kDa的融合蛋白，而且重组表达质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达产物主要是以包涵体形式存在的，将得到的包涵体融合蛋白纯化后免疫小鼠，分离小鼠血清，得到FS

5、Hl3多克隆抗体，对多克隆抗体进行ELISA和WesternBlot检测，结果表明抗体的效价为1：256000，特异性较好。3．对FSHl3基因在9～23周龄家兔的卵巢、输卵管、子宫、睾丸和输精管等生殖器官扬州大学硕士学位论文中的表达水平进行实时荧光定量PCR检测。结果表明，FSH[3基因在5个生殖器官中均有表达，13周龄各组织间表达量差异不显著(P>0．05)，各组织中随周龄的变化FSHD基因的表达呈现出一定的规律，总体来说，在13～15周龄时表达量均较高。因此，FSH]B基因在其它生殖组织中也可表达，且在初情期前后的表达量最高。关键词：家兔；促卵泡激素D(FS

6、HfI)基因；原核表达；多克隆抗体制备；实时荧光定量PCR石福岳家兔促卵泡激素B(FSHl3)基因克隆及表达研究IIICloningandExpressionAnalysisofRabbitFollicle·-StimulatingHormone13l(FSH131)geneM．S．Candidate：SHIFu-yueSupervisor：Prof．WUXin-shengMajor：AnimalGenetics，BreedingandReproduction(collegeofAnimalScienceandTechnology,YangZhouUniversi

7、ty,YangZhou,225009)AbstractFollicleStimulatingHormoneisaglycoproteinhormonesynthesizedandsecretedbyanimalspituitarybasophiliccellswhichcomposedofalphaandbetasubunits．ThebetasubunitisdeterminantsofFollicleStimulatingHormonebiologicalactivityandimmunologicalactivity．Therearesomestudiesh

8、avesh