不同培养条件海洋微生物胞外多糖的结构与免疫活性研究

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1、谨以此论文献给尊敬的导师于广利教授和我的家人及关心支持我的老师朋友们------刘亚男不同培养条件海洋微生物胞外多糖的结构与免疫活性研究不同培养条件海洋微生物胞外多糖的结构与免疫活性研究摘要本文从2株海洋微生物在6种不同培养基中的发酵液中提取得到12种胞外粗多糖，在对其进行基本理化性质分析基础上，进一步对其免疫活性进行了研究。主要研究结果如下：1.在12种胞外粗多糖中，AF3、AF2、SEK1及SEK3多糖得率较高，分别为10.1%，9.7%，8.0%及7.9%。运用高效液相色谱法（HPLC）、红外光谱（IR）、高效凝胶渗透色谱法（HPGPC）等方法对所有胞外粗多糖的单糖组成、官能团性质及分

2、子量等进行了分析比较。结果表明12种胞外粗多糖均不含糖醛酸；AF4，AF6，SEK4均不含硫酸根，其余样品含有少量硫酸根。AF4，AF6及SEK4中主要是Glc，分别为85.5%，80.4%和87.0%；AF1，AF3，SEK5及SEK6的中主要为Man和Glc，分别占总单糖比例的72.5%，80.7%，81.9%和81.3%；AF2、SEK1、SEK2、SEK3中主要是Man，分别达66.5%、67.5%、52.9%、73.5%。#2.以含Man含量高且多糖得率高的AF3为对象，通过732阳离子交换柱层析、CaptoQ阴离子交换柱层析及SepharylS100凝胶柱层析对其进行分离纯化，得

3、到多糖组分AF3-A1及AF3-A2，其中AF3-A1相对分子量32kDa，总糖含量85.9%，不含蛋白以及硫酸根、糖醛酸等酸性基团，单糖种类主要含有Man（＞95%），属于中性甘露聚糖。通过甲基化GC/MS、NMR、MS等方法对纯化后多糖组分AF3-A1结构进行解析，表明，AF3-A1是以(1→6)-α-D-Manp为主链，C-2位存在一定分支结构，是由聚合度从2-5不等的β-D-Manp和(1→2)-α-D-Manp的甘露聚糖组成。3．粗多糖AF3经CaptoQ阴离子交换柱分离纯化0.6M盐洗得到的组分AF3-A2的相对分子量82kDa，总糖含量79%，蛋白含量15%，不含硫酸根、糖醛酸

4、等酸性基团；单糖中以甘露糖与半乳糖的摩尔比为8.3:1.7，是主要含甘露糖的杂多糖，属于半乳甘露聚糖肽。同样通过甲基化GC/MS、NMR、MS等方法对AF3-A2多糖结构进行解析。结果表明AF3-A2是以α-D-(1→6)-Manp为主链，C-2位存在一定的分支结构，其支链中的一部分是由聚合度从2-5不等的-D-(1→2)Manp、-D-(1→2)-Manp--D-(1→3)-Manp及β-D-Galf(1→组成。4．对12种不同培养条件海洋微生物胞外多糖、2种纯化多糖及2种甘露寡不同培养条件海洋微生物胞外多糖的结构与免疫活性研究糖混合物体外对小鼠免疫调节作用进行研究。结果表明，微生物

5、多糖体外对正常小鼠脾淋巴细胞、胸腺淋巴细胞增殖能力普遍高于甘露聚糖肽注射液的增殖能力，且在一定范围内呈剂量依赖趋势；粗多糖体外对正常小鼠脾淋巴细胞、胸腺淋巴细胞增殖作用普遍高于纯化后多糖及甘露聚寡糖混合物；样品与阳性对照品ConA及LPS发生协同作用，共同促进正常小鼠免疫细胞代谢活力；粗多糖AF3及SEK1体外对正常小鼠胸腺细胞具有促进作用，可以显著增强正常小鼠胸腺细胞代谢活力。另外在这16种胞外多糖及寡糖混合物体外抗H1N1活性实验中，粗多糖体外抗甲型流感病毒株A/PR/8/34（H1N1）抑制率高于纯化后多糖及甘露聚寡糖混合物，其中AF3的抑制率最高，为69.6%，初步证明AF3是一种良

6、好的免疫调节剂。本论文获得了2种结构新颖的甘露聚糖，其良好的免疫调节和抗H1NI病毒活性，为其深入研究并开发为免疫调节药物奠定了基础。关键词：海洋微生物；胞外多糖；结构；甘露聚糖；免疫调节活性不同培养条件海洋微生物胞外多糖的结构与免疫活性研究StructureandimmuneactivitystudyofextracellularpolysaccharidesproducedbymarinemicroorganismsunderdifferentfermentationconditionsAbstractInthispaper,the12kindsofextracellularpolysa

7、ccharideswereisolatedfromtwodifferentsourcesofmicrobialfermentedliquidwith6differentmediums,withbasicphysicochemicalpropertieswereanalized.Andtheimmunityactivitieswereanalizedfurthermore.Themainfindingsarea