人用狂犬病毒核蛋白、糖蛋白定量检测试剂的研制及应用

《人用狂犬病毒核蛋白、糖蛋白定量检测试剂的研制及应用》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、南方医科大学2010级硕士学位论文人用狂犬病毒核蛋白、糖蛋白定量检测试剂的研制及应用Developmentandapplicationofhumanrabiesvirusnucleoprotein，glycoproteinquantitativedetectionreagents课题来源：企业委托项目学位申请人导师姓名专业名称培养类型培养层次所在学院黄黉吴英松教授免疫学全日制非定向生物技术学院2013年堂月／o日广州f嗍嬲硕士学位论文人用狂犬病毒核蛋白、糖蛋白定量检测试剂的研制及应用硕士研究生：黄黉指导教师：吴英松教授摘

2、要研究背景及目的狂犬病病毒(RabiesVirus，RV)属于弹状病毒科，狂犬病病毒属，形态呈子弹状，长180nirl，直径75nnl，其头部为半球形，末端常为平端，病毒颗粒由外壳和核心两部分组成。其基因组由11928"-11932个核苷酸组成，为单链、不分节段的负链RNA，含5个大的开放阅读框，编码5种结构蛋自。基因组从3’端至5’端的排列顺序为N、P、M、G和L基因，分别编码病毒核蛋白(nucleoprotein，NP)、磷蛋白(phosphoprotein，NS)、膜基质蛋白(matrixprotein，MP)、糖

3、蛋白(glycoprotein，GP)和转录大蛋白(polymerase，LP)。近年来的研究表明，狂犬病毒疫苗诱导机体产生中和抗体的免疫应答反应主要与核蛋白和糖蛋白有关。核蛋白在病毒颗粒中数量众多，占病毒蛋白总量的36％。核蛋白基因序列相对恒定，点突变较少，不同株系的同源性在98％～99．6％，是病毒中最稳定的蛋白，可用作检测抗原，也是狂犬病病毒基因分型的主要依据。核蛋白能诱导保护性免疫。它是一种能诱导对不同型狂犬病病毒产生交叉保护的T辅助细胞(Th)抗原，蛋白的21"'35区域、394----408区域、404--一

4、418区域是主要的Th细胞表位。狂犬疫苗接种后，人外周血分离到的狂犬特异性的反应T细胞要比其它疫苗接种后分离到的特异性T细胞数量多，在这些特异性反应T细胞中，摘要多数是Th细胞，它们绝大多数表现对核蛋白特异性反应，提示核蛋白是诱导狂犬病细胞免疫的主要成分。此外，核蛋白还能促进中和抗体的产生。把NP加福氏完全佐剂初免小鼠后，用灭活狂犬病毒加强，中和抗体水平明显上升，而用GP加强，中和抗体产生不明显。NP抗体还能抑制狂犬病毒在细胞间的传播和在细胞内的繁殖。因此，核蛋白是狂犬病毒疫苗组分中不可缺少的成分之一，是评价疫苗活力的一

5、个重要指标。GP是狂犬病毒中唯一能刺激机体产生中和抗体的抗原，其抗原性的保持主要依赖于其空间构象。狂犬病毒GP的结构特点与其抗原性和免疫原性密切相关，它在刺激机体产生免疫应答的过程中发挥重要作用。GP是狂犬病毒的主要保护性抗原。具有B、T细胞识别位点，能够诱导机体发生细胞和体液免疫应答，刺激机体分泌中和抗体。因此，糖蛋白羧基末端是否缺失及其主要抗原位点空间构象是否被破坏或缺失是衡量狂犬疫苗抗原活力好坏的另一个关键性指标。狂犬病毒核蛋白、糖蛋白含量是狂犬病疫苗的主要质量指标，在精制狂犬病疫苗的研制过程中常需要及时进行抗原含

6、量的检测，多年来一直用NIH动物法测定。该方法测定周期长，操作繁琐，以及国际动物保护协会对实验动物使用的制约，不适用于提纯过程中各步骤的监测。因此，寻求可靠的体外检测狂犬病毒疫苗效力的实验方法来替代NIH法势在必行。本研究采用时间分辨免疫荧光分析(TI强IA)技术研制人用狂犬病毒N蛋白、G蛋白定量检测试剂，评价各项性能指标，并与其它检测试剂盒进行比较，评价其在临床检测应用中的可行性。时间分辨免疫荧光分析(TIUIA)是以稀土离子标记抗原或抗体、核酸探针和细胞等为特征的新型的非放射性免疫标记技术，它克服了ELISA酶标记物

7、的不稳定、O．D值仅在低浓度范围与酶活性呈线性关系，Hook效应严重、酶的活性容易失活，灵敏度不高等缺点，使非特异性信号降低到可以忽略的程度，达到极高的信噪比，从而大大地超过了放射性同位素所能达到的灵敏度，且还具有标记物制备简便、储存时间长、无放射性污染、检测重复性好、操作流程短、标准曲线范围宽、不受样品自然荧光干扰硕士学位论文和应用范围十分广泛等优点，成为继放射免疫分析之后标记物发展的一个新里程碑，已成为生物医学研究和临床超微量生化检验中一项最有发展前景的分析手段，有望未来实现代替NIH法为检测狂犬疫苗效力。方法：采用

8、双抗体夹心法研制人用狂犬病毒核蛋白定量检测试剂，评价各项性能指标；采用杂交瘤融合法制备狂犬病毒糖蛋白单克隆抗体。1．人用狂犬病毒N蛋白定量检测试剂的研制与应用1．1狂犬病毒N蛋白抗原的制备：根据狂犬病病毒CTN株N基因序列设计引物，提取狂犬病毒CTN株疫苗。总,RNA，采用AMV酶逆转录获得cDNA，利用PCR的方法