全自动（定量pcr）基因扩增诊断仪配套定量试剂的研制论文

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1、全自动（定量PCR）基因扩增诊断仪配套定量试剂的研制论文.freelent-platemetricallyamplifiedbyabio-labeledup-streamprimer，thesinglestringPCRproductspleprobeandthepetitiveprobeined.Theresultofquanti-tativeassayplatecanbequantifiedbythiskit.ThesimplepreparationofsamplesDNAisalsoadaptedtothiskitandtheresultscanberepea

2、ted.CONCLUSIONThiskitcanbeusedininstru-mentandquantifythecontentofHBVDNAinserum.0引言用PCR技术进行核酸定量分析，有较大的难度.首先，PCR在扩增过程中，初期扩增产物量与循环数呈指数关系，在扩增后期进入平台期，定量分析应在指数关系区进行.但由于PCR扩增效率受多种因素的影响，使得这种定量条件很难控制.二是临床样品中待测核酸含量值跨度很大（可能在1～106拷贝/μL），对于跨度如此之大的检测对象，要进行准确定量本身就很困难.竞争PCR定量方法虽不受扩增平台期现象的影响，但该方法定量的量程

3、窄，要测定临床标本的核酸含量，就需用多个不同浓度的竞争模板分别对同一样品进行多次检测.为了克服竞争PCR定量方法的缺点，便于仪器自动检测，我们采用竞争PCR产物杂交―酶标显色法进行分级定量.这种定量方法克服了以往竞争PCR定量的不足，初步实现了半定量核酸分析.1材料和方法1.1材料主要仪器与试剂:全自动（定量PCR）基因扩增仪（本所）;pUC19HBVDNA质粒为本所克隆.引物与探针:PCR引物源于HBVDNAX基因区［1］，引物:B1（1402～1421）5’-BioATCCT-GCGCGGGACGTCCTT3’;B2（1626～1607）5’-CGTTCACGG

4、TGGTCTCCATG3’，探针位置与序列为（1600～1580）5’HRP-TGCACTTCGCAT-CACGTCTGG3’，其5’端标记有辣根过氧化物酶（HRP），由美国MaximBiotech.Inc制备.血清标本:72例HBVDNA阳性血清，由本校西京医院检验科提供.20例HBVDNA阴性血清，由本校西京医院中心血库提供.1.2方法经典DNA提取方法按文献［2］进行.简便DNA提取法:30μL血清加入30μL处理液（10mmolL-1Tris-HClpH8.0，1mmolL-1EDTA，1mLL-1NP40）煮沸15min，7000g离心5min，吸取上清5

5、μL作PCR模板［3］.亲和素包被微孔板按文献［4］进行.不对称竞争PCR扩增［3］:PCR反应体积为30μL，其中引物B1，B2分别为50pmol，1pmol.扩增条件为:首先94℃预变性2min，然后94℃30s，60℃40s，72℃40s共循环25次，取PCR产物10μL进行杂交酶标显色.杂交酶标显色检测［5］:准确吸取两份PCR反应产物各10μL，按1∶9分别稀释（稀释液:4.3mmolL-1Na2HPO4，1.4mmolL-1K2HPO4;0.5mLL-1TmolL-1NaCl，2.7mmolL-1KCl，pH7.2）于待测微孔和竞争微孔中，混匀后，再分别

6、从中各吸取10μL溶液，再同样按1∶9分别稀释于新的待测微孔和竞争微孔中，混匀后，再同前稀释1次，这样待测产物和竞争产物各有3个微孔，稀释度分别为10-1，10-2，10-3，37℃放置10min，然后弃去微孔内溶液，用包被液洗2次，再加入100μL探针溶液（1μmolL-1探针），于震荡器上37℃震摇20min，用包被液洗微孔3次，加入显色底物100μL（0.1gL-1TMB，0.3mLL-1H2O2），37℃放置10min，加入0.5molL-1H2SO4终止液50μL终止显色反应，用全自动（定量PCR）基因扩增仪测定450nm下的吸光度（A）算出定量结果.2结

7、果2.1定量PCR方法的灵敏度将pUC19HBVDNA质粒定量稀释成每管105拷贝、104拷贝、103拷贝、102拷贝和10拷贝用该定量方法进行定量检测，循环程序为25次，准确吸取扩增产物10μL进行PCR产物杂交酶标显色，杂交酶标显色法可检测到初始模板量为10拷贝（Fig1）.2.2杂交酶标显色法的特异性对10份HBVDNA阳性和10份HBVDNA阴性标本进行PCR扩增25个循环以后取产物进行杂交酶标显色，10份HBVDNA阳性标本最终A分别为1.121，3.000，2.080，2.258，0.646，1.252，1.143，0.389，0.912，0.537