扩增效率荧光定量pcr原理

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1、荧光定量PCR实验原理及数据分析MarketingDep.IcyWu内容概要荧光定量PCR的原理荧光定量PCR的标记方法荧光定量PCR解析方法荧光定量实验流程及注意事项生工荧光定量产品选择指南2www.sangon.com荧光定量PCR原理－－定义实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析与常规PCR技术比较：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析，无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测www.sangon.com3荧光定量PCR原理－－常用名词概念扩增曲线

2、荧光阈值Ct值www.sangon.com4荧光定量PCR原理－－扩增曲线www.sangon.com5Cycle（循环数）Rn（荧光强度）BaselineLg－linerphase平台期荧光基团荧光检测元件荧光定量PCR原理－－荧光阈值www.sangon.com6Cycle（循环数）Rn（荧光强度）BaselineLg－linerphase平台期前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline）荧光阈值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍手动设置:大于荧光背景值和阴性对照的荧光最高值；进入指数期的最初阶段真正的信号:荧光信号超过阈值Thres

3、hold荧光定量PCR原理－－Ct值www.sangon.com7Cycle（循环数）Rn（荧光强度）Ct值的定义：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数Ctvalue荧光定量PCR原理－－Ct值的重现性www.sangon.com8横轴：PCR反映循环数纵轴：荧光信号量Ct值的特点：相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；Ct值极具重现性荧光定量PCR原理－－Ct值定量的数学原理www.sangon.com9理想的PCR反应Xn＝X02n*Xn：第n次循环后扩增产物数量X0：起始模板数量n：扩增循环数荧光定量PCR原理－－Ct

4、值定量的数学原理www.sangon.com10非理想的PCR反应Xn＝X0（1＋En）n*Xn：第n次循环后扩增产物数量X0：起始模板数量n：扩增循环数En：扩增效率荧光定量PCR原理－－Ct值定量的数学原理www.sangon.com11在扩增产物达到荧光阈值时XCt＝X0*（1＋En）Ct＝M（1）整理方程式（2）：方程式（1）两边同取对数得：XCt：荧光扩增信号达到阈值时扩增产物的量，在阈值设定以后，它是一个常数，定为MLog2M＝Log2X0*（1＋En）Ct（2）Log2X0=Log2M-CtLog2（1＋En）荧光定量PCR原理－－Ct值与起始模板量的

5、关系www.sangon.com12CyclenumberCk104Ck102SampleLgofDNAconcentration模板DNA量越多，荧光达到阈值的循环数越少，即Ct值越小。Log模板起始浓度与Ct值呈线性关系。荧光定量PCR原理－－荧光定量反应性的确认www.sangon.com13线性关系、扩增效率确认相关系数（R2）：大于0.98标准曲线斜率：-3－-3.5PCR扩增效率（E）：0.9-1.2检测灵敏度确认35Cycles内可得到好的定量结果如果采用SYBR检测方法，30Cycles内无非特异性产物扩增Notemplatecontrol确认35C

6、ycles内无引物二聚体产生内容概要荧光定量PCR的原理荧光定量PCR的标记方法荧光定量PCR解析方法荧光定量实验流程及注意事项生工荧光定量产品选择指南14www.sangon.com常用荧光定量标记方法www.sangon.com15非特异性荧光标记SYBRGreenI特异性荧光标记TaqManProbeSYBRGreenI染料法－－原理www.sangon.com16SYBRGreenI是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。SYBRGreenISYBRGreenI染料法－－作用机理www.sangon.com17热变性引物退火延伸反应

7、SYBRGreenI染料法－－问题点与关键点www.sangon.com18问题点：SYBRGreenI与双链DNA进行结合后散发荧光，因此如果反应体系中有非特异性扩增或引物二聚体的产生，也将同时被检测，从而可能导致检测结果不准确。关键点：设计合适引物，防止非特异性扩增！SYBRGreenI染料法－－融解曲线www.sangon.com19将温度与荧光强度的变化求导(-dI/dT)原始图谱对数图谱SYBRGreenI染料法－－融解曲线www.sangon.com20融解曲线分析，单一峰无非特异性荧光：定量准确融解曲线分析，出现杂峰其他产物出现非特异性荧光：定量不