全自动（定量pcr）基因扩增诊断仪配套定量试剂的研制

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1、全自动（定量PCR）基因扩增诊断仪配套定量试剂的研制　　摘要:目的研制一种能用于仪器操作的灵敏、快速、特异的定量试剂.方法使用一个生物素标记的上游引物，对HBVDNA及其竞争模板DNA进行不对称PCR扩增，使扩增出的单链带有生物素，并可结合在固定有链亲合素的微孔板的表面.用标有辣根过氧化物酶的待测模板探针和竞争模板探针分别与两个微孔中固定的相应单链PCR产物杂交，而后加底物显色，测定吸光度进行分级定量分析.结果该定量方法可以检测10拷贝数的模板，而且对简便处理的标本适应性强;以分级定量的形式定量时，具有良好的重复性.结论该试剂适用于仪器操作，可对临床血清中HBVDNA进行分级定

2、量分析.　　Keyent-platemetricallyamplifiedbyabio-labeledup-streamprimer，thesinglestringPCRproductspleprobeandthepetitiveprobeined.Theresultofquanti-tativeassayplatecanbequantifiedbythiskit.ThesimplepreparationofsamplesDNAisalsoadaptedtothiskitandtheresultscanberepeated.CONCLUSIONThiskitcanbeusedi

3、ninstru-mentandquantifythecontentofHBVDNAinserum.　　0引言　　用PCR技术进行核酸定量分析，有较大的难度.首先，PCR在扩增过程中，初期扩增产物量与循环数呈指数关系，在扩增后期进入平台期，定量分析应在指数关系区进行.但由于PCR扩增效率受多种因素的影响，使得这种定量条件很难控制.二是临床样品中待测核酸含量值跨度很大（可能在1～106拷贝/μL），对于跨度如此之大的检测对象，要进行准确定量本身就很困难.竞争PCR定量方法虽不受扩增平台期现象的影响，但该方法定量的量程窄，要测定临床标本的核酸含量，就需用多个不同浓度的竞争模板分别对同

4、一样品进行多次检测.为了克服竞争PCR定量方法的缺点，便于仪器自动检测，我们采用竞争PCR产物杂交―酶标显色法进行分级定量.这种定量方法克服了以往竞争PCR定量的不足，初步实现了半定量核酸分析.　　1材料和方法　　1.1材料主要仪器与试剂:全自动（定量PCR）基因扩增仪（本所）;pUC19HBVDNA质粒为本所克隆.引物与探针:PCR引物源于HBVDNAX基因区［1］，引物:B1（1402～1421）5’-BioATCCT-GCGCGGGACGTCCTT3’;B2（1626～1607）5’-CGTTCACGGTGGTCTCCATG3’，探针位置与序列为（1600～1580）5’

5、HRP-TGCACTTCGCAT-CACGTCTGG3’，其5’端标记有辣根过氧化物酶（HRP），由美国MaximBiotech.Inc制备.血清标本:72例HBVDNA阳性血清，由本校西京医院检验科提供.20例HBVDNA阴性血清，由本校西京医院中心血库提供.　　1.2方法经典DNA提取方法按文献［2］进行.简便DNA提取法:30μL血清加入30μL处理液（10mmol・L-1Tris-HClpH8.0，1mmol・L-1EDTA，1mL・L-1NP40）煮沸15min，7000g离心5min，吸取上清5μL作PCR模板［3］.亲和素

6、包被微孔板按文献［4］进行.不对称竞争PCR扩增［3］:PCR反应体积为30μL，其中引物B1，B2分别为50pmol，1pmol.扩增条件为:首先94℃预变性2min，然后94℃30s，60℃40s，72℃40s共循环25次，取PCR产物10μL进行杂交酶标显色.杂交酶标显色检测［5］:准确吸取两份PCR反应产物各10μL，按1∶9分别稀释（稀释液:4.3mmol・L-1Na2HPO4，1.4mmol・L-1K2HPO4;0.5mL・L-1Tmol・L-1NaCl，2.7mmol・L-1KCl，pH7.2）

7、于待测微孔和竞争微孔中，混匀后，再分别从中各吸取10μL溶液，再同样按1∶9分别稀释于新的待测微孔和竞争微孔中，混匀后，再同前稀释1次，这样待测产物和竞争产物各有3个微孔，稀释度分别为10-1，10-2，10-3，37℃放置10min，然后弃去微孔内溶液，用包被液洗2次，再加入100μL探针溶液（1μmol・L-1探针），于震荡器上37℃震摇20min，用包被液洗微孔3次，加入显色底物100μL（0.1g・L-1TMB，0.3mL・L-1H2O2），