酵母表面展示etmic1蛋白不同结构域与其作为抗球虫活载体疫苗的分析

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1、2．2．1柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子总RNA的提取及eDNA的合成⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．172．2．2EtMICl基因的扩增、克隆与测序⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯182．2．3真核表达载体的构建⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．：。202．2．4酵母细胞的转化及筛选⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯222．2．5免疫与攻虫⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯252．2．6免疫保护力评价⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯252．2．7抗体水

2、平检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．262．2．8体外诱导细胞因子及其表达水平检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯272．2．9T淋巴细胞转化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．272．2．10CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．282．2．11统计分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．283结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．293．1

3、EtMICl基因克隆及序列分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．293．2重组展示载体的构建及酶切鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯’⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯303．3酵母表面展示EtMicl蛋白片段的鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．323．3．IIFA鉴定EtMiel蛋白片段在酵母细胞表面的展示⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．323．3．2流式细胞仪检测EtMicl蛋白片段在酵母细胞表面的展示⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。343．3．3Western．blot检测EtMicl蛋白片段在酵母细胞表面的展示⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

4、⋯⋯．353．4抗柔嫩艾美耳球虫免疫保护效果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯363．4．1体重增长⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。363．4．2卵囊排出量及卵囊减少率⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．373．4．3盲肠病变计分⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯373．4．4抗球虫指数(ACI)⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．383．5血清中特异性抗体水平⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯393．6脾淋巴细胞

5、亚群检测及脾淋巴细胞转化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯403．7细胞因子水平的检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯414讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。435结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．476参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。487致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。5

6、68发表论文情况⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。579附勇乏⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．58山东农业大学硕士学位论文中文摘要鸡球虫病是由一种或多种艾美耳科、艾美耳属的球虫寄生于鸡的肠上皮细胞内所引起的寄生原虫病，是对养禽业造成巨大经济损失的疾病之一。目前，球虫病在养禽业的控制策略主要是采用抗球虫药、强毒活疫苗、减毒活疫苗。但他们自身存在的一些缺点使得鸡球虫病的预防未能达到理想的效果，因而研发廉价高效的新型疫苗已成为缓解养禽业亏

7、损的当务之急，随着现代生物技术的不断提高，鸡球虫基因／DNA疫苗，及亚单位疫苗的研究越来越引起人们的重视，此类疫苗与活苗相比具有一定的优势，但其仍有很多局限性。而活载体疫苗具有免疫效力高、生产成本低及安全性能好等不可比拟的优势，为新型球虫疫苗的研发提供了重要方向。首先筛选鉴定保护性蛋白质抗原是研制活载体疫苗的关键，柔嫩艾美耳球虫微线蛋白1(EtMicl)可以作为新型疫苗的候选抗原来阻断子孢子侵入宿主细胞。其次选择合适的传递载体对于研制活载体疫苗也是非常重要的。而在众多活载体疫苗传递系统中，酿酒酵母表面展示系统可作为一

8、个独特的真核表达系统，适用于表达球虫抗原。酿酒酵母表面展示系统不仅具有疫苗传递的便利性，当接种酵母口服活疫苗时，酵母细胞壁还能增强机体先天性免疫。因此，在本研究中，我们从SD．01株柔嫩艾美耳球虫的第二代裂殖子总RNA中扩增并克隆了EtMICl基因，并根据EtMICl不同结构域将其分成3段：EtMICl．I包括I．结构域、TSP．1和TSP．2