大肠杆菌生产琥珀酸的辅因子代谢调控研究

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1、大肠杆菌生产琥珀酸的辅因子代谢调控研究TheResearchofCofactorMetabolicRegulationforSuccinateProductionbyEscherichiacoli（国家973项目NO.2011CBA00804）（国家973项目NO.2012CB725203）（重大项目NO.21390201）（国家自然科学基金青年基金项目NO.21206112）学科专业：生物化工研究生：王白云指导教师：赵学明教授天津大学化工学院二零一四年六月万方数据独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包

2、含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得天津大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：签字日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解天津大学有关保留、使用学位论文的规定。特授权天津大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。（保密的学位论文在解密后适用本授权说明）学位论文作者签名：导师签名：签字日期：年月日签字日期：年月万方数据摘要氧化还原辅因子

3、NADH能为诸多生物基产品更高效的合成提供驱动力，ATP是胞内维持细胞生长和活力的主要能量物质。本课题通过提高大肠杆菌胞内辅因子NADH、ATP的供给，以增强大肠杆菌合成琥珀酸的性能。通过扰动磷酸戊糖途径（Pentosephosphatepathway，PP途径），增强辅因子NADPH和NADH的转化效率，过表达ATP合成偶联的关键酶基因，阻断副产物合成途径，琥珀酸得率从1.12mol/mol葡萄糖提高到1.56mol/mol葡萄糖，达到理论得率的91%。PP途径是细胞NADPH的主要来源，在大肠杆菌中NADPH可被转氢酶SthA转化为NADH，因此提高厌氧条件下PP途径的通量，可为琥珀酸的

4、合成提供还原力NADH。以大肠杆菌ZTK为出发菌，过表达谷氨酸棒杆菌解除变构抑制的突变酶基因zwf(243)-gnd(361)，琥珀酸的得率从1.12mol/mol葡萄糖增加到1.26mol/mol葡萄糖，提高12.5%。进一步过表达了PP途径的相关基因pgl、talB、tktA，琥珀酸的得率提高至1.3mol/mol葡萄糖。增强PP途径通量后，过表达sthA（编码转氢酶SthA）促进NADPH转化为NADH。发酵结果显示，sthA的过表达明显提高琥珀酸的得率，达到1.44mol/mol葡萄糖，但菌体生长速率和琥珀酸合成速率都不同程度的下降。为改进厌氧条件下菌体生长和琥珀酸合成速率，琥珀酸合

5、成菌WSA140中表达产琥珀酸放线杆菌的pck基因（偶联ATP生成），敲除ppc，同时过表达大肠杆菌pck基因，得到工程菌株WSA146。WSA146的菌体生长得到明显改进，且琥珀酸的得率达到1.42mol/mol葡萄糖。进一步敲除乙酸合成途径ack-pta，乙酸的产量下降了8-9倍，胞外浓度仅约3mM，琥珀酸得率提高到1.56mol/mol葡萄糖，琥珀酸最大合成速率为2.44mmol/L/h。关键词：琥珀酸大肠杆菌磷酸戊糖途径NADHATP万方数据AbstractRedoxcofactorNADHisabletobeadrivingforceformoreeffectiveproducti

6、onofmanybio-basedproducts.ATPisthemainenergyintracellularformaintainingcellgrowthandvitality.ThispaperfocusesonimprovingsusccinateproductioninEscherichiacolibasedonreducecofactor(NADH)regeneration,energysupply.Succinateyieldwasincreasedfrom1.12mol/molglucoseto1.56mol/molglucosebydisturbanceofPPpath

7、way,enhanceoftheconversionbettweenNADHandNADPHanddeletionofcompetivepathway.InE.coli,PPpathewayisthemainsourcesofNADPHandNADPHcanbeconvertedintoNADHbytranshydrogenaseSthA.ThusimprovingthefluxofPPpathwaycanp