桑螟β-呋喃果糖苷酶基因的克隆与功能研究

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1、万方数据II万方数据摘要植物会在昆虫噬咬部位渗出大量乳汁或其他分泌物来抵抗虫害。桑叶乳汁中含有大量1-脱氧野尻霉素(1-DNJ)等生物碱对蓖麻蚕等非食桑昆虫具有毒害致死作用。家蚕不受桑叶生物碱的毒害作用，其分子机制尚不明确。家蚕β-呋喃果糖苷酶(β－FFase)基因BmSuc1是首个报道的动物型该类中肠蔗糖水解酶基因，在家蚕抵抗桑叶生物碱的机制中可能起到一定的作用。桑螟(DiaphaniapyloalisWalker)是一种与家蚕亲缘关系较远但食性一致的桑树常见害虫，对桑园产量的危害相当严重。桑螟的基因组中同样存在β-FFase同源基因，但该类基因在桑螟的体内外表达情况及功能特性尚不清楚。本

2、实验首先调查了桑螟体内各组织中β-FFase同源基因的转录水平。RT-PCR结果表明DpSuc1a在前肠、中肠和丝腺的表达量相对较高，DpSuc2c在前肠、中肠和脂肪体的表达水平也较高，而DpSuc1b、DpSuc2a和DpSuc2b在桑螟体内几乎没有表达。其次，研究了桑螟的中肠和丝腺总蛋白的β-FFase酶活性。检测结果表明和家蚕一样，桑螟的中肠确实存在β-FFase，且其活性不受生物碱的影响，具有较高的蔗糖水解酶的活力，而在丝腺中未检测到β-FFase活性。为了进一步研究桑螟各β-FFase基因的功能特性，我们根据实验室前期研究得到的桑螟β-FFase基因的cDNA序列设计特异性引物，经

3、PCR扩增获得了桑螟5个β-FFase基因和家蚕BmSuc1的全长ORF，构建了原核表达重组质粒，转化、诱导各基因在大肠杆菌中表达，并对重组蛋白进行了纯化。Westernblot检测结果表明除DpSUC1b未表达外，其他基因均表达出可溶性的重组蛋白。然而，相对BmSUC1的活性而言，桑螟的各重组蛋白均未显示出β-FFase的酶活性。而用重组蛋白DpSUC1a制备的兔源多克隆抗体进行Westernblot印迹反应的结果和RT-PCR一致，DpSUC1a主要在桑螟的中肠表达。免疫组织化学分析结果也表明桑螟的中肠细胞中有DpSUC1a的存在。综合以上数据，桑螟β-FFase基因DpSuc1a的表达

4、调控机制可能与家蚕不一样，主要依赖于翻译后的修饰和加工。作为桑树的主要害虫之一，桑螟是杀虫剂的重要作用对象。对桑螟β-FFase的研究有助于从分子进化水平研究食桑昆虫抵抗桑叶生物碱毒害作用的酶学适应机制，为揭示蚕-桑高度协同进化系统的分子调控机理奠定基础，为进一步开发新型抗虫靶标、防治桑园害虫的应用研究提供理论依据。关键词：桑螟，家蚕，生物碱，β-FFase，基因功能表达I万方数据AbstractPlantlatexandotherexudatesatthepositionofdamagecausedbyinsectherbivoryaredefensivesystemagainstinse

5、ct.Mulberrylatexcontainsextremelyhighconcentrationsofalkaloidalsugarmimics,suchas1-deoxynojirimycin(1-DNJ),whichareeffectiveglycosidaseinhibitorsandhighlytoxictotheinsectsthatdonotnormallyfeedonmulberryleaves.Althoughthesecompoundsdonotharmthesilkworm,Bombyxmori,thedefensemechanismshavenotbeenwelld

6、ocumented.BmSuc1,asucrosehydrolasegeneinB.mori,isthefirstclonedβ-fructofuranosidase(β-FFase)genefromanimalintestine.BmSuc1mayplayanimportantroleintheprocessofsilkwormresistingmulberryalkaloids.DiaphaniapyloalisWalker,acommonmulberrypest,isadistantlyrelatedspeciesbuthasconsistentdietswithB.mori.Larv

7、aeofD.pyloalisdoveryseriousharmtotheproductionofmulberryfields.Wepreviouslyfoundthattherearefiveβ-FFasehomologousgenesinthegenomeofD.pyloalis.Theexpressionpatternsandfunctionalfeaturesofthesegenesinvitroand