蛋白4.1r对cd8+t淋巴细胞的活化、增殖和功能的影响

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1、AthesissubmittedtoZhengzhouUniversityforthedegreeofMasterProtein4．1RnegativelyregulateCD8+Tcellactivation，1●^’●^‘proliferationandIunctionByYiLiSupervisor：Prof．ZhenyuJi，Prof．QiaozhenKangMasterofCellBiologySchoolofLifeScienceApril，2014原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已

2、经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。学位论文作者：压办日期沩眸岁月如学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位

3、论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。学位论文作者：德嘞E1期功(9年3月；母It广、摘要蛋白4．1R对CD8+T淋巴细胞的活化、增殖和功能的影响背景及目的蛋白4．IR首先是在成熟的红细胞中被发现的，大小为80KD细胞膜骨架蛋白分子，因为在红细胞膜蛋白SDS．PAGE后位于4．1染色条带处而得已命名。4．1R是将红细胞跨膜蛋白和血影蛋白．肌动蛋白骨架网络连接起来的桥梁，对维持红细胞正常形态、粘附、脆性及生理功能中发挥重要作用，人类4．1R基因的表达缺失会导致遗传性椭圆型红细胞增多症(Hered

4、itarydliptocytosis)，发生溶血性贫血，红细胞失去正常形态。4．1R基因敲除小鼠的红细胞膜骨架结构改变，细胞膜表面蛋白分子分布异常。近年来研究发现，4．1R及后来发现的4．1R同源家族成员4．1N、4．1G、4．1B在有核细胞中广泛表达，其中4．1N主要分布在神经系统，4．1B主要分布在脑组织，4．1G广泛分布，而4．1R则在红细胞及同样来源于骨髓多功能造血干细胞的淋巴细胞中高表达。4．1R在成熟红细胞中的功能及作用机制目前已经研究得比较深入，而4．1R在有核细胞中，特别是在T细胞中的功能及作用机制还不十分清楚。本课题组成员在前期研究中首次发

5、现并报道了4．1R在CD4+T淋巴细胞中与免疫突触形成有关，且证实4．1R与LAT(T细胞活化连接子)直接结合并抑制ZAP一70对LAT的磷酸化，在CD4+T淋巴细胞活化和信号转导的起始阶段发挥着负调控作用。但4．1R在CD8+T淋巴细胞活化中的免疫生理效应及作用机制在国内外均未见报道。CD8+T淋巴细胞活化后形成的效应T淋巴细胞(CTL)可以直接杀伤肿瘤细胞，分泌细胞因子如：删小IL-2等也可以间接激活机体的免疫系统来增强机体的抗肿瘤能力。鉴于CD8+T淋巴细胞在抗病毒感染、抗肿瘤免疫、急性同种异型移植等过程中重要作用，研究4．1R基因表达缺失在CD8+T

6、淋巴细胞活化中的作用及调控机制显得十分迫切。本研究通过对美国纽约血液中心引种回国的具有C57BL／6J遗传背景的4．1R摘要基因敲除小鼠进行培育和繁殖，利用4．1R基因敲除小鼠和4．1R表达缺失的CD8+T淋巴细胞，了解4．1R对TCR／CD3启动的CD8+T淋巴细胞活化、增殖、细胞周期、细胞因子产生及移植瘤耐受性等方面的影响，为进一步研究4．1R在CD8+T淋巴细胞活化过程中的作用机制和通路提供实验依据。方法本研究采用具有C57BL／6J遗传背景的4．1R基因敲除小鼠和野生型的C57BL／6J小鼠作为实验模型。1．无菌取小鼠的淋巴结，免疫磁珠法获得CD8+

7、T细胞，流式检测CD8+T细胞的纯度。2．获得野生型(4．1R+／+)和4．1R基因敲除(4．1R乒)两种CD8+T淋巴细胞，提取总RNA后反转录成eDNA，PCR反应及琼脂糖电泳进行基因型鉴定。测序鉴定CD8+T淋巴细胞中蛋白4．1R剪切体外显子组成。3．通过流式细胞仪检测4．1R+件和4．1R乒两种基因型CD8+T淋巴细胞表面CD69的表达，从而分析蛋白4．1R表达缺失对CD8+T淋巴细胞早期活化的影响。4．利用流式细胞检测和CCK-8的方法研究4．1R基因缺失对小鼠CD8+T淋巴细胞增殖和细胞周期的影响。5．利用ELISPOT方法，检测4．1R+件和4

8、．1R-／。两种基因型CD8+T淋巴细胞IFN-7、