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1、牛磺酸抑制缺氧诱导大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖和信号转导机制［收稿日期］2013-10-16［基金项目］国家自然科学基金项目(81270113,91339107)；研究生创新基金项目(YJSCX2012-ZZ8HSD)；哈尔滨科技创新人才项目(2013RFXXJ092)；大庆重点项目(SCXZ01011)［通信作者］*孙鹏，E-mail：sunpenghashangda@126.com［作者简介］张晓丹，教授，E-mai1:zhangxd85@163.com［摘要］目的：探讨牛磺酸(taurine,Tau)对缺氧诱导的大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)增殖的影响，并且研究细胞外
2、信号调节激酶1/2(ERK1/2)通路是否参与了Tau抑制PASMCs增殖的过程及可能的分子机制。方法：原代培养大鼠PASMCs,选用第2〜5代用于实验。Tau给药浓度为80mmol・L-1,ERK1/2阻断剂(PD98059)浓度为50nmol•L-1,给药时间24ho①体外嗟11坐蓝比色法(MTT)、细胞免疫荧光和蛋白免疫印记法检测牛磺酸在不同条件下对大鼠PASMCs增殖能力的影响，将细胞分为4组：常氧组、常氧+Tau组、缺氧组、缺氧+Tau组。②蛋白免疫印记法检测ERK1/2通路是否参与了Tau抑制缺氧诱导PASMCs增殖的进程中。实验分为5组：常氧组、缺氧组、缺氧+T
3、au组、缺氧+Tau+PD98059组、缺氧+PD98059组。结果：①缺氧可诱导PASMCs增殖，常氧情况下Tau对PASMCs细胞增殖无影响，常氧及缺氧条件下Tau对PASMCs中肿瘤坏死因子-a(TNF-a)的表达无影响。Tau可以逆转缺氧诱导的细胞增殖核抗原(PCNA)(P1.4免疫荧光测PCNA6孔板中放入盖玻片，细胞消化后均匀铺于6孔板的盖玻片上，细胞生长密度适宜后给药，细胞给药时间结束后，PBS冲洗细胞,4%多聚甲醛固定15min后弃掉，再用PBS冲洗3次，每次5mine加入0.5%Triton透化穿孔10min,PBS洗3次，每次5mino加入3%BSA,37
4、°C下封闭30min。PBS洗后6孔板中每孔加入PCNA—抗4£孵育过夜。第2天回收一抗，PBS洗5min,一共3次，6孔板中每孔加入100nLCy3荧光二抗，避光37°C下孵育2ho时间结束后PBS洗3次，每次5mine每孔加入100uLDAPI孵育15min。PBS洗3次，每次5min。抗淬灭剂封片，置于荧光显微镜下观察。1.5免疫蛋白印迹分析各组加药培养24h后收集细胞，预冷的磷酸盐缓冲溶液反复冲洗细胞3遍，加入细胞裂解液，冰上裂解15min后刮取细胞，低温离心机4°C下13500r•min-1离心15min,取上清，釆用BCA法测定蛋白浓度。蛋白溶液按4:1比例加入5
5、Xloadingbuffer,95°C煮5min,8%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，将蛋白转印到NC膜上，转膜结束后，用5%脱脂奶粉封闭lh,加入1：400稀释的一抗4°C孵育过夜。次日回收一抗，TBST洗膜液洗膜4次，每次10min,辣根过氧化酶标记的兔二抗、鼠二抗孵育lh,TBST振荡洗膜4次，每次10mineECL显色5min后显影。曝光后X光片在QuantityOne软件中进行分析。1.6统计学分析应用SPSS6.0软件进行统计学分析，t检验和方差分析，P图6Tau对p-ERKl/2表达的影响（土s，n=6）Fig.6Effectoftaurineonp-ERKl/
6、2expressionofPASMCs（±s,n=6）Tau相比，PD98059+Tau组PCNA表达下降最显著（P[参考文献][1]GhofraniHA,VoswinckelR,ReichenbergerF,etal.Hypoxiaandnon-hypoxia-relatedpulmonaryhypertentionestablishedandnewtherapies[J]・CardiovascRes,2006,72：30.[2]OuditGY,TrivierMG,KhaperN,etal.Taurinesupplementationreducesoxidativestre
7、ssandimprovescardiovascularfunctioninaniron—overloadmurinemodel[J].Circulation,2004,109：1877.[3]HidemiNonaka,TakeshiTsujino,YasuhiroWatari,etal.Taurinepreventthedecreaseinexpressionandsecretionofextracellularsuperoxidedismutaseinducedbyhomocysteine[J]・Ci
