基因修饰的人羊水祖细胞宫内移植小鼠模型的研究

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1、上海交通大学2009级博士学位论文基因修饰的人羊水祖细胞宫内移植小鼠模型的研究Early-stageengraftmentofamnioticprogenitorcellswithgeneticmodificationinuterotransplantationinamousemodel学科专业发育生物学学号0097109010研究生杨辰敏指导教师曾凡一研究员导师组成员任兆瑞研究员陈美珏副研究员薛燕副研究员申请学位级别博士培养单位上海交通大学基础医学院答辩日期2012年4月26日1万方数据上海交通大学2009级博士学位论文基因修

2、饰的人羊水祖细胞宫内移植小鼠模型的研究Early-stageengraftmentofamnioticprogenitorcellswithgeneticmodificationinuterotransplantationinamousemodel学科专业发育生物学学号0097109010研究生杨辰敏指导教师曾凡一研究员研究方向干细胞与遗传病的基因治疗申请学位级别博士资助基金项目国家重大科学研究计划（2007CB947800）国家杰出青年科学基金(81125003）关键词人羊水祖细胞宫内干细胞移植血友病B人凝血因子IX培养单位上

3、海交通大学基础医学院答辩日期2012年4月26日2万方数据万方数据万方数据上海交通大学2009级博士学位论文基因修饰的人羊水祖细胞宫内移植小鼠模型的研究摘要血友病B是由凝血因子IX（FIX）缺乏所引起的X连锁隐性遗传性出血疾病，需终生治疗，且费用昂贵，因此人们希望通过基因治疗来改善患者的症状。hFIX的表达不需要精确地调控,少量提高即可改善患者的出血症状,凝血因子的分泌无脏器特异性，因此血友病长期以来被认为是一种适合基因治疗的疾病。多数针对出生后的个体的基因治疗，效果不佳，大多在短期内FIX的表达就下降了。近年来的研究表明，干细

4、胞宫内移植（InUteroStemCellTransplantation，IUSCT）是克服移植免疫排斥反应的一种有效途径。在胎儿的免疫系统尚未发育成熟时，通过宫内注射的方法将干细胞输入到胎儿体内，使干细胞能在受体体内归巢并增殖分化，从而达到治疗疾病的目的。干细胞作为基因的一种载体是研究的热点之一，胚胎干细胞最具全能性，但由于伦理上的争议限制了其使用。人们在羊水中发现了具有干性的胎儿细胞，这些细胞具有类似胚胎干细胞的功能，而没有研究胚胎干细胞的伦理问题。为了使羊水细胞宫内移植能应用到临床实践，首先需在动物体内进行宫内治疗的实验研

5、究，通过建立羊水干细胞嵌合体动物模型来探讨干细胞在体内的各种生物学特征和功能，为宫内治疗的实施奠定理论和技术基础。首先，我们通过富含各种生长因子的培养液筛选贴壁的羊水细胞，再用机械分离的方法得到形态均一的羊水祖细胞(hAFPC)，这种细胞呈长梭形，增殖速度快，并表达NANOG，SOX2，SSEA4和TRA1-60等胚胎干细胞的特异性蛋白，经诱导能成脂肪分化和成骨分化。接着，我们构建了hFIX和GFP共转染的质粒，以慢病毒系统转染了羊水祖细胞后使用流逝细胞仪筛选出GFP阳性的细胞，进一步培养后发现，羊水细胞能够在mRNA水平表达h

6、FIX和GFP,并且在细胞上清液中检测到了持续稳定表达的FIX蛋白，以及与之相应的FIX活性。由此我们证实羊水祖细胞转染了hFIX片段后能够持续合成有凝血活性的hFIX。应用改良的宫内移植注射器，我们将这种基因修饰的羊水祖细胞移植到12.5d的胎鼠腹腔中，嵌合率达到50%以上。移植的细胞主要归巢到小鼠的肝脏和脂肪组织，其中肝脏中外源细胞的含量可达5万方数据上海交通大学2009级博士学位论文55.71±21.02%。出生3个月后仍能检测到外源基因的表达。受体小鼠的外周血中我们也检测到了高于1%的hFIX浓度，同样可持续到出生后3个

7、月。本研究为羊水来源的干细胞应用于血友病B的产前治疗提供了实验基础，也为宫内治疗遗传性疾病提供新的途径。转染了hFIX基因的羊水祖细胞可能成为血友病B基因治疗的新型细胞来源本研究建立了分离和培养羊水祖细胞的稳定系统，在体外证实这种细胞转染了hFIX片段后能够长期稳定的表达有活性的hFIX蛋白。我们首次建立了异种异体(人／鼠嵌合)的羊水祖细胞宫内移植小鼠模型，同时检测到受体小鼠体内hFIX在基因水平和蛋白水平均有表达，并能维持3个月以上。因此，羊水祖细胞能成为基因可靠的载体，我们将进一步在血友病B的疾病小鼠模型上进行该细胞的移植并

8、观察治疗效果。关键词：人羊水祖细胞宫内干细胞移植血友病B人凝血因子IX6万方数据上海交通大学2009级博士学位论文Early-stageEngraftmentofamnioticprogenitorcellswithgeneticmodificationinut