耐辐射球菌中reca的调控蛋白研究

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1、浙江大学博士学位论文耐辐射球菌中RecA的调控蛋白研究姓名：盛多红申请学位级别：博士专业：生物物理学指导教师：华跃进20050201浙江入学博士学位论文耐辐射球菌中RecA的调控蛋白砌}究耐辐射球菌中RecA的调控蛋白研究摘要本研究是对耐辐射球菌抗辐射机制研究的一部分，耐辐射球菌是迄今为止发现的最抗辐射的生物之_，它可以耐受剂量超过15kGy的电离辐射而不发生突变，以往的研究发现耐辐射球菌的抗辐射表型和细胞内有效的损伤DNA修复有关，RecA在修复过程中扮演着重要角色，破坏recA基因后，耐辐射球菌失去了绝大部分辐射抗性。基因组

2、测序发现，耐辐射球菌基因组缺乏recB、recC、recE、recd．recO和recT等参与重组修复的关键基因，RecA蛋白究竟以什么方式参与细胞内DNA损伤修复还是一个谜。尽管发现pprl基因参与了耐辐射球菌RecA的表达，但对RecA的调节机制仍然还不了解。本文参照一般细菌RecA的调节模式，发现耐辐射球菌编码三个RccA调节蛋白类似物，包括两个LexA和一个RecX，通过对它们的功能分析，研究RecA的调控机制，对揭开耐辐射球菌的高抗辐射机制有重要启发意义。LexA是recA转录中的一个重要的抑制子。在大多数革兰氏阴性菌

3、和革兰氏阳性菌中，RecA的表达受DNA损伤的诱导，并激活其辅蛋白酶活性催化LexA自裂解，释放包括recA在内的多种DNA损伤诱导基因的表达。耐辐射球菌内有两个LexA蛋白同源物，它们都具有LexA蛋白结构域，包括DNA结合结构域，保守的裂解位点(Ala-Gly)和C末端的自裂解蛋白酶，可被RecA催化进行自裂解反应。Narumi等的研究认为其中的一个LexA同源物(dra0344)不参与recA基因的诱导表达，这使得了解另一个LexA同源物(dra0074)的活性对研究ReeA调控更有意义。本文构建了基因dra0074的突变

4、菌株，通过免疫杂交和启动子活性分析，对比了野生型和突变体中ReeA的表达。实验数据表明，LexA(dra0074)同样不参与recA基因的诱导表达，论证了耐辐射球菌RecA的表达不需要LexA蛋白。进一步的蛋白质组学分析发现LexA(dra0074)的功能可能与细胞内的某种代谢有关。RecX是一个调节蛋白；发现于许多细菌中，它的编码基因位于recA的下游，并且两个基因通常共转录。一般认为RecX能够直接下调RecA蛋白活性，降低RecA过表达对细胞的损伤。和大多数细菌不同，耐辐射球菌的recX同源基因(drl310)位摘要于染色

5、体l上，距离recA基因较远，它的具体功能还未作研究。本文构建了基因drl310的突变菌株和过表达菌株，细胞水平分析表明耐辐射球菌RecX对RecA的活性具有抑制作用；进一步的实验发现，RecX不仅可以在蛋白质水平抑制RecA蛋白的重组活性、ATP酶活性和辅蛋白酶活性，还可以在基因表达水平直接抑制RecA的表达，表现出了双重抑制活性，揭示RecX参与了RecA表达的负调节机制。辐射产生的活性氧是造成细胞损伤的重要原因，因此抗氧化机制是细胞抗辐射的一个重要组成部分，RecX的缺失提高了细胞内的抗氧化活性；通过对耐辐射球菌中重要的抗

6、氧化酶CAT和SOD活性的分析，发现RecX蛋白不影响CAT和SOD蛋白的活性，而是直接抑制它们的表达。尽管还不清楚RecX对抗氧化活性的影响和其调控RccA功能的关系，RccA，CAT和SOD都参与了耐辐射球菌的辐射损伤诱导反应，对它们表达的抑制表明RecX参与了这一诱导反应，RecX表现出了多方面的抑制活性。为了进一步了解RecX蛋白在耐辐射球菌中的功能，进行了双向电泳分析实验。通过比较野生型和突变体的电泳图谱以及随后的蛋白点的质谱鉴定，在鉴定出的36种蛋白中，发现RecX可以抑制包括RecA、SSB、PprA、SOD等DN

7、A损伤诱导蛋白在内的12种蛋白的表达，同时可以提高其他23种蛋白的表达量，他们分别属于基因转录、蛋白表达、物质转运和代谢，能量转运和代谢等途径。上述结果表明，RecX参与了辐射诱导的DNA损伤反应，RecX缺失的情况下，可以释放包括recA在内的多种DNA损伤诱导基因的表达、抑制多种细胞内正常的代谢，包括氨基酸，糖类和脂类代谢，以及能量代谢，似乎与DNA损伤检测点反应有关。综上所述，耐辐射球菌的LexA(dra0074)是～个调节蛋白，但是不参与RecA的诱导表达：RecX作为耐辐射球菌辐射抗性的一个多功能抑制子，参与了RecA

8、活性的调节，在基因组稳定性和辐射诱导的重组修复中起着双重负调节作用。关键词：D．radiodurans，RecA，RecX，LexAV浙}【．人学

9、尊士学位论文耐辐射球菌中RecA的调控蛋F{研究RegulatoryproteinsofRecAinDeinoco