耐辐射球菌dna修复开关基因ppri的研究

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1、浙江大学博士学位论文耐辐射球菌DNA修复开关基因pprI的研究姓名：高冠军申请学位级别：博士专业：生物物理学指导教师：华跃进20050501博士学位论文单位代号：幽研究生学号：!Q21§Q塑耐辐射球菌DNA修复开关基因即玎的研究答辩委员会主席：匿王丞院±(浙江大学)论文评阅人●eLll喜＆f2、1定一办々拿屺疑赳积u7论文答辩日期项目支持本研究为国家重点基础研究发展计划(课题编号：2004CB719604)、国家自然科学基金重点项目(批准号：30330020)和国家杰出青年基金(批准号：30425038)资助项目。SUPPoRrI’PRoJECTThisw

2、orkwassupportedbyagrantoftheNationalBasicResearchProgramofChina(GrantNo．2004CBl9604)，agrantfortheDistinguishedYoungScientistsofChina(GrantNo．30330020)，andakeyprojecttheNationalNaturalScienceFoundationofChina(GrantNo．30425038)．摘要耐辐射球菌(Deinococcusradiodurans，简称DR)是迄今为止地球上发现的辐射抗性最强的生

3、物之一，因对电离辐射、紫外线、干燥及一些DNA损伤试剂显示超强的抗性，一直倍受生物医学界和环境工程界的关注和重视。该细菌能够在几十个小时内准确无误地修复由辐射产生的几百个双链DNA碎片(Double．strandbreaks，DSBs)而不发生任何突变，但目前这种DNA修复机制尚不清楚。现有研究表明，DR菌在极端环境(电离辐射、紫外线、干燥)下的生存是保护、耐受和修复三方面协同作用的结果，是独特的新陈代谢转换途径和高效精确的DNA修复系统有效地协调了DNA的损伤修复。因此，发现和研究新的与DNA修复及抗逆性相关的功能基因(或酶)并阐明它们的生物学功能对进一

4、步探索DR菌的极端抗性与DNA修复机制具有重要的理论意义和应用价值。作为同源重组修复途径的重要蛋白，DR菌ReeA在DNA修复中起十分重要的作用。DR菌recA基因的突变株对电离辐射异常敏感。研究表明，DR菌缺乏多数原核生物中存在的LexA介导的SOS修复途径，虽然基因组内两个LexA同源物都可被RecA催化进行自裂解反应，但都未参与recA基因的调控。据此推测，DR菌可能存在与其它原核生物迥然不同的DNA修复机制和途径。近来，我们筛选DR菌自然变异株时发现一株对电离辐射较为敏感的突变株，初步研究表明，该突变株的辐射敏感性是由基因组内编号为DR0167的基

5、因(命名：pprl)内部插入了一个转座子而发生了突变。本研究主要围绕这一新发现的DNA损伤修复开关；基lNpprI，应用分子生物学的方法迸一步鉴定该基因，研究该基因分子作用机制及相关的生物学问题，研究PprI结构域与功能的关系，并应用蛋白质组学的方法进一步探索Ppd在辐射抗性方面的网络调控机制，研究结果如下：1．为鉴定DRNpprl基因与辐射抗性之间的关系，本研究首先构建TDR菌pprI基因内部反向插入抗生素抗性基因的突变株。研究发现，该突变株对电离辐射极为敏感，初步推NPprI是一个与DNA修复有关的辐射抗性因子。为进一步研究PprI生物学功能和作用机制

6、，分别克隆pprl、recA和pprA基因，表达纯化了相应的蛋白质产物，并制备了多克隆抗体。Westernblotting结果表明，DRglgppr瑾因能够促进辐照条件下DNA修复基因recA和pprA的诱导表达，并能提高细胞清除自由基的能力。2．为研究DR菌DNA修复因子PprI在其它生物中所起的生物学作用，将印r瑾因通过穿梭表达质粒导入到模式生物大肠杆菌(Ecob)中。结果表明，尽管在Ecob中没有找到PprI显著同源物，但PprI在EcoliO?的表达同样能够提高细胞电离辐射抗性和抗氧化能力，并能显著增强Ecoli过氧化氧酶(KatE)的活性。3．作

7、为DR0167一DR0170基因簇的第一个基因，pprl苗J反向插入突变没有影响随后基INfolP(DR0168)的表达：引物延伸实验表明，声胪的启动子存在于印，瞄构基因内部；pprl和foIP基因各自独立转录，不存在调控关系，扣驴基因突变与印棚；勺表达及辐射抗性没有关系：辐照前后pprINfoIP的启动子活性都没有显著变化，表明pprl的转录调控可能基于蛋白质(翻译或修饰)水平。4．在DR菌细胞内构建了两个穿梭表达质粒pRADKNpRADG。pRADK含有DR菌自薹tgroEL动子(PgroEL)与卡那霉素抗性基因融合的穿梭质粒，转化DR菌可产生2099

8、／ml的卡那霉素抗性。用该质粒可以构建DR菌任何基因任意位置含有卡