基于耐辐射球菌的生物传感器的构建以及耐辐射球菌drasnf2基因的分析

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1、摘要基于对极端抗辐射细菌——耐辐射球菌(DeinococcusradioduransR1)的遗传改造，我绱祷建了一个窭时垒细脆生物传感器来检测高放射性环境中的放射性物质和遗传毒物。该系统瑷可受DNA损伤诱导调控翡关键基溜——孵鲥蒸霾翡岩动予柞感受谬子，议加强型绿色荧光蛋巍(eGFP)作报告因子，制髑大肠杆菌鸯对辐射球餐昀穿梭质粒俸载体导入到宿主蓄醛辐射球菌获得了生辏传感器菌株DRG300。该菌株可以在recA基鑫启动子的萼l发下表达eGFP蛋白，从褥在488nm紫外线激发下发出绿色荧光．摄据耐辐射球菌活细胞中荧光强度和eGFP蛋白表达量之间的相关性，我们发现在D

2、RG300菌株中荧光强度潮DNA损饬霹予魄如￥射线和墼裂霉索C(MMC)之阍，在一定范围之内存在很显著的裁量正相关性．葡过去一些文献中报道昀金细胞传感器相钯，我们所构建的这个重组菌株璃对具有广阚的剂量探测范匿和较高的灵敏度．研究结果表明，DRG300可律为一个潜在全细胞生物传感器，基予诧拘建昀检测系统，可驳髑来实越鉴测环境孛敖射性和毒性污染物所造成的生物学危害。全基因组测序发现耐辐射球菌中存在大量的未知基因，而借于基因芯片和蛋白质组学昀研究表唠煮部分功能未知基因对电离辐射胁迫蠢类似＆跬酶表达谱恧表达量既ReeA燕大，这为寻找recA基西之外的DNA损伤感应园子提

3、供可能．基于此类DNA损伤修复穗关基因进行构建全细胞生物传感器检测环境中昀DNA损伤因子，并基于新的荧光报告基露系筑，探索功整未知基因昀表达特性，我{}】耨建了基于ddrA秘ddrB基嚣启动予PddrA葶鞯PddrB的金细胞生物传感器。通过将廖动子PddrA静PddrB分别穗pRADZ3演粒融合后，转化入耐辐射球菌Rl菌株。剂用一种基于8．半乳糖苷酶酶活测定耦联荧光素酶活性，构建一种有较高灵敏度和稳定性，检测手段曼是便捷的全细脆感受器梭测系统。并通过毫离辐射和MMC下检测菌株的发光特性，揭示了ddrA和ddrB在表达方式上同recA差异的证据．赞对耐辐射球菌镌S

4、nf2家族残员DraSNF2，我翻遵过测序，确认了DRl258和DRl259组成了一个完整的ORF，编码一个Snf2家族蛋鸯。裁们分析了此蛋盘的保守结构域，发现去除内含肽的DraSNF2刚Snf2家族中的SS01653贬家族成员霭很高的同潦性，黉与Snf2箕毽亚家族蛋蠹甓显隰离开寒。通过与SS01653蓝家族成员皆巴知结橇蛋巍鳇对比，预测了其可能具有的生化特性和生物学功能。通过基因敲除突变，构建了draSNF2基因的Vl突变株，经过DNA损伤实验，发现draSNF2对耐辐射球菌的极端抗辐射特性并不是必需的。VllAbstractBasedonagenetical

5、lymodifiedradioresistantbacteriaDeinococcusradiodurans，weconstructedarealtimewholecellbiosensortomonitorradioactivityandgenotoxicityinhi曲Iyradioactiveenvironment。Theerahancedgreenfluorescenceprotein(eGFP)wasfusedtothepromoterofacrucialDNAdamage—induciblerecAgenefrom／9．radiodurans，and

6、theconsequentDNAfragment(PrecA-eg兹o)carriedbyplasmidwasintroducedintonradioduransR1straintoobtainthebiosensorstrainDRG300．ThisengineeredstrainCallexpresseGFPproteinandgeneratefluorescenceininductionoftherecAgenepromoter．Basedonthecorrelationbetweenfluorescenceintensityandproteinexpre

7、ssionlevelinliveD：radioduranscells，wediscoveredthatthefluorescenceinductionofstrainDRG300respondsinaremarkabledose-dependentmannerwhentreated诚m转NAdamagesourcessuchasgammaradiationandmitomycinC。Itisencouragingtofindthewidelydetectiverangeandhi曲sensitivityofthisreconstructedstraincompa

8、ring、蕊也other