耐辐射球菌中抗氧化蛋白dps（drb0092）的研究

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1、中文摘要耐辐射球菌(Deinococcusradiodurans)是地球上已知的辐射抗性最强的生物之一，它以对电离辐射、紫外线、干燥以及一系列DNA损伤试剂显示超强的抗性而著称。已有的研究显示，抗氧化保护体系和高效的DNA损伤修复能力是该菌具有超强抗性的关键因素。然而，耐辐射球菌体内存在的这种极端抗性机制至今仍不明确。因此，研究和鉴定耐辐射球菌体内DNA保护及抗氧化相关的功能蛋白(或酶)，阐明它们的生物学功能和生化特性，对进一步理解耐辐射球菌的极端抗性机制和探索其潜在的应用价值具有非常重要的意义。Dps(斟A幽tectionduri

2、ngstarvation)蛋白是一类只存在于原核生物中具有抵抗多种逆境压力功能的含铁蛋白，与真核生物铁蛋白(Ferritin)和细菌铁蛋白(Bacterioferdtin)共同组成铁蛋白超家族。Dps蛋白能通过两种机制有效保护DNA免受损伤：1)Dps能结合游离态亚铁离子，从而防止多余的Fe2+和H202发生Fenton反应产生羟自由基攻击DNA；2)Dps蛋白与DNA直接结合形成结构致密的蛋白一DNA生物共结晶体，从而在物理形态上保护DNA免受活性氧自由基(reactiveoxygenspecies，ROS)等有害物质的攻击。耐辐

3、射球菌全基因组中有两个基因编码Dps蛋白，分别是位子I号染色体上的DR2263和位于大质粒上的DRB0092基因。关于前者的生化特性和晶体结构特征已有详细的文献报道。本研究围绕后者，应用生物信息学和分子生物学的方法进行鉴定，并对其基因功能和蛋白生化特性进行分析。研究结果如下：1．运用生物信息学方法对DRB0092基因和蛋白序列进行分析。发现DRB0092蛋白存在类似Ferritin(铁蛋白)的保守结构域，进一步证明了该蛋白属于铁蛋白超家族。通过ClustaIW程序对DRB0092蛋白和其它细菌Dps蛋白进行多序列比对，结果显示DRB

4、0092蛋白与其它物种Ops蛋白的同源性并不高，但其N．端前端存在富含赖氨酸(Lys)保守位点的区域，可能为DNA结合结构域；蛋白中部存在Hisl00、Aspl27和Glul31等保守氨基酸残基，推测为铁氧化酶(ferroxidasc)保守结构域。此外，分析结果显示DRB0092蛋白在其N一端还具有其它Ops蛋白没有的信号肽，预示着DRB0092蛋白可能具有其它Dps蛋白不具有的生化特性。2．用体外三段连接和体内同源重组的方法对DRB0092进行全基因缺失突变。分析突变株和野生型菌株在电离辐照和过氧化氢处理下的生存率曲线，结果显示突

5、变株的生存率较野生型均有明显下降，而突变株补偿Ops蛋白则能完全恢复野生型的表型。此外，Native-PAGE活性染色结果表明，DRB0092的缺失导致耐辐射球菌体内过氧化氢酶(cAT)活性上调，H202压力条件下差异尤为显著。3．通过在大肠杆菌中过表达DRB0092重组蛋白，我们得到纯化的Dps-2重组蛋白，并对其进行体外生化功能鉴定．结果显示：在交联剂戊二醛作用下，含50mMNaCI的缓冲液中的单体Dps-2蛋白能形成三聚体、四聚体和十二聚体等各种多聚体形式；单体Dps．2蛋白不能结合pUCl9质粒，但多聚体Dps-2蛋白能与质

6、粒DNA发生非特异性结合，并能保护质粒DNA免受Fe2+和H202发生Fenton反应产生的羟自由基损伤。综上所述，耐辐射球菌的Dps-2蛋白(DRB0092)具有明显的DNA保护和抗氧化功能，在该菌的抗氧化体系中扮演举足轻重的角色，可能是该菌极端抗性机制的重要组成部分。关键词：耐辐射球菌；Ops蛋白；生物信息学；基因突变；抗氧化；DNA保护2ABSTRACTDeinococcusradioduransisoneofthemostextraordinaryradiation-resistantorganismsontheearth．

7、Italsohasahi曲resistancetodesiccation,UV-ray,oxidativestreSSandavarietyofDNAdamagingagents．AlthoughalotofstudiesshowedthatthesemultipleresistantphenotypcsWaSattributedtoitsanti-oxidantsystemandhighlyefficientDNArepairprocess，themechanismoftheextremeresistanceinthisbacte

8、riumisstillunclear．Therefore，itisofsignificancetoidentifyandstudyonthefunctionalproteinswhichareinvolvedinDNArepairan