在不动杆菌对碳青霉烯类耐药机制中外排泵及外膜蛋白表达作用的研究

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1、北京协和医学院硕士研究生学位论文中文摘要【目的】探索在体外碳青霉烯类抗菌药物选择性压力作用下导致的耐药突变菌株中，主动外排泵系统及外膜蛋白表达对碳青霉烯类耐药所起的作用。【方法】从SEAN取监测琼脂稀释法药敏数据库中选择碳青霉烯类敏感的不动杆菌，用AI①I认技术对菌株进行分子水平上的鉴定。将入选的亲代敏感菌株在体外亚胺培南、美罗培南碳青霉烯类抗菌药物选择性压力作用下，筛选出碳青霉烯类耐药突变菌株，并用触①RA对其进行鉴定。通过＆心D、PFGE、Diversilab和MLST4种分型方法对亲代敏感菌株和耐药突变株进行同源性分析。选择遗

2、传背景密切相关而碳青霉烯类耐药表型不同的亲代敏感菌株和其耐药突变菌株，用琼脂稀释法对其进行药物敏感性实验；另外，与药物敏感性实验同步进行，在抗菌药物中加入外排泵抑制剂氰氯苯腙(CCCP)，观察其对实验菌株MIC的影响，初步探索耐药突变菌株是否存在主动外排泵系统；用普通PCR和基因测序的方法对常见碳青霉烯酶及其插入序列、整合子、外排泵及其调节基因、外膜蛋白鲫D基因进行分析；用SDS．PAGE电泳检测不动杆菌外膜蛋白表达情况；并用实时荧光定量PCR检测不动杆菌主要外排泵系统AdeABC及其调节基因和c甜D基因的表达水平。【结果】本研究入

3、选的6株碳青霉烯类敏感的不动杆菌，√U①I认鉴定为4株2型鲍曼不动杆菌、1株基因组3型不动杆菌和1株13TU型不动杆菌，各菌株的亚胺培南和美罗培南耐药突变菌株ARDRA结果与亲代菌株一致。从亚胺培南和美罗培南体外筛选耐药菌株的过程可以得出：美罗培南更容易诱导出耐药菌株，但其诱导的美罗培南耐药菌株大多对亚胺培南敏感，而亚胺培南诱导的耐药菌株，对美罗培南表现为高耐的现象。PFGE、黜心D、Diversilab和MLST4种分型方法的结果显示：每株菌的亲代敏感菌株和其体外选择耐药突变株同源性密切相关；凡心D和Diversilab的分辨力比

4、PFGE差，不能区分亲缘关系相近的菌株，pu6l亲代敏感菌株及其耐药突变菌株与pu53亲代敏感菌株及其耐药突变菌株RAPD和DiversilabDNA显示密切相关，但PFGE显示两株菌间相差7个条带以上，无亲缘关系；MLST虽然基因组3型不动杆菌砌B和印fPCR扩增或测序失败，但与其他分型方法相比，表现为遗传背景一致的菌株具有相同的ST型。伊DD非简并引物对基因组3型不动杆菌和基因组13TU型不动杆菌扩增效果不好。体外筛选的碳青霉烯类耐药不动杆菌呈现多重耐药表型，仅对粘菌素、米诺环素表现为很好的抗菌活性，耐药率<2％，碳青霉烯类抗菌

5、药物的抗菌活性亚胺培南>美罗培南。亚胺培南和美罗培南E．test法和琼脂稀释法药敏结果相差在2个稀释浓度范围内，但最终判定的药敏表型一致。CcCP可以降低抗菌药物的MIC，加入CCCP后各抗菌药物的耐药率均有不同程度的下降，外排泵表型阳性菌株分布中耐药菌株所占构成比率最高。统计学分析CCCP对抗菌药物敏感性的影响，结果显示美罗培南、环丙沙星、头孢曲松、北京协和医学院硕士研究生学位论文头孢吡肟、头孢噻肟和哌拉西林一他唑巴坦加入和不加入CCCP两组药物敏感性表型构成比具有统计学差别，p值均

6、鲍曼不动杆菌表达OXA．51外，均不表达碳青霉烯酶和插入序列，少数几株菌表达ESBLs和存在I类整合子，但整合子只携带了对氨基糖甙类、磺胺和消毒剂耐药的基因。AdeABC外排泵系统完整性及础R、口沈文和础口内部保守序列的序列分析显示各菌株的亲代敏感菌株和其耐药突变菌株具有相同的特点。基因组13TU型不动杆菌表达口出B泵基因。22株细菌AbeMN外排泵系统均阳性，AdeDE外排泵系统均阴性，包括基因组3型不动杆菌。基因组3型不动杆菌缺失鲫D基因，其他菌株c甜D基因全长序列分析没有发现插入序列。SDS．PAGE电泳显示习69亚胺培南和美

7、罗培南筛选的耐药突变菌株与其敏感菌株相比外膜蛋白表达无明显差别，另外5株不动杆菌美罗培南中介或耐药菌株与其各自敏感菌株相比，均表现为31．6l(DOMP表达减弱或缺失。硅胶柱DNaseI消化提取的RNA无基因组DNA的污染，且质量和浓度均满足后续实验。内参基因16SrIⅢA及各目的基因的标准曲线均满足相关系数，．的绝对值>0．98，斜率在．3．O~-3．5之间。扩增曲线呈标准的S形曲线，融解曲线分析各个基因均呈现特征性的峰图，无非特异产物或引物二聚体。荧光定量PCR双标准曲线法相对定量分析显示，相对于16srRNA内参基因，除个别碳

8、青霉烯类耐药菌株外，外排泵系统础B、础R和口比S基因的表达量均有不同程度的上升，而鲫D基因的表达量有不同程度的下降。【结论】亚胺培南和美罗培南两种碳青霉烯类药物体外诱导不动杆菌耐药的能力不同，可能两者在体外诱导不动杆菌耐药方面存在不同