耐碳青霉烯类不动杆菌的耐药机制与分子流行病学研究

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分类号：R446学校代码：10392学科专业代码：100208学号：2121003237硕士学位论文耐碳青霉烯类不动杆菌的耐药机制与分子流行病学研究ResistanceMechanismsandMolecularEpidemiologyinCarbapenem-ResistantAcinetobacterspp.ClinicalIsolates学位类型：医学硕士所在学院：协和临床医学院申请人姓名：傅芬蕊学科、专业：临床检验诊断学导师：郑培烝副教授研究起止日期：2013年08月至2015年02月答辩委员会主席：伍严安教授答辩日期：2015年05月29日二○一五年五月 学位论文原创性声明和版权使用授权书学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的真实成果。除文中己注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的作品成果。对本论文的研宄做出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。作者签名（手写）：导师签名（手写）^年A月d日年ir月之％学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构（如国家图书馆、中国学术期刊电子杂志社的《中国优秀博硕士学位论文数据库》、中国科学技术信息研宂所的《中国学位论文全文数据库》等）送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权福建医科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。(保密的学位论文需办理相关手续，在解密后适用本授权书)作者签名（手写)年ok月d曰力(r年t月 目录中文摘要..................................................1英文摘要..................................................4中英文缩略词表............................................7前言......................................................8第一部分耐碳青霉烯类不动杆菌的碳青霉烯酶基因研究........111.材料与方法........................................112.结果..............................................153.讨论..............................................21第二部分携带NDM-1型基因的不动杆菌耐药机制研究.........241.材料与方法........................................242.结果..............................................303.讨论..............................................33第三部分福州市耐碳青霉烯类不动杆菌分子流行病学研究......371.材料与方法........................................372.结果..............................................403.讨论..............................................41结论.....................................................46参考文献.................................................47综述.....................................................59致谢.....................................................70 福建医科大学硕士学位论文耐碳青霉烯类不动杆菌的耐药机制与分子流行病学研究摘要目的:1.了解福州市临床分离的耐碳青霉烯类不动杆菌耐药性的产生与B类和D类碳青霉烯酶之间的关系。2.探讨A类碳青霉烯酶、外膜孔蛋白和外排泵在携带NDM-1型基因的耐碳青霉烯类不动杆菌中的作用。3.研究NDM-1、NDM-6及NDM-9型酶对亚胺培南的水解能力。4.研究福州市临床分离的耐碳青霉烯类不动杆菌的分子流行病学特点。方法:1.收集2010年9月~2014年8月福州市临床分离的391株非重复的耐碳青霉烯类不动杆菌，采用VITEK-2compact全自动微生物分析仪进行菌种鉴定和药敏试验，然后通过K-B法验证菌株对亚胺培南的耐药性。通过42℃生长实验、OXA-51-like基因检测和rpoB基因序列分析进行菌种鉴定。PCR法检测B类和D类碳青霉烯酶基因。2.对携带有NDM-1型基因的不动杆菌，运用PCR法筛查A类碳青霉烯酶基因、外膜孔蛋白基因和外排泵基因。构建含NDM-1、NDM-6及NDM-9型酶的pCR2.1载体，导入TOP10感受态细胞中，利用琼脂稀释法测定不同类型重组菌对亚胺培南的最小抑菌浓度值。3.利用DiversiLab细菌DNA指纹图谱分析系统对福州市临床分离的50株耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌、5株Pittii不动杆菌和3株Nosocomialis不动杆菌进行基因分型。在50株耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌中，39株来自福建医科大学附属协和医院，9株来自福建医科大学附属第一医院，2株来自南京军区福州总医院。5株Pittii不动杆菌和3株Nosocomialis不动杆菌均来自福建医科大学附属协和医院。1 福建医科大学硕士学位论文结果：1.①391株耐碳青霉烯类不动杆菌中，382株为鲍曼不动杆菌，5株为Pittii不动杆菌，4株为Nosocomialis不动杆菌。②在382株耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌中，OXA-23-like基因阳性率为93.46%（357株），OXA-24-like基因阳性率1.05%（4株），OXA-58-like基因阳性率0.52%（2株），均未检出OXA-143-like基因；2株检出NDM-1型基因。③在5株Pittii不动杆菌中，2株检出OXA-58-like基因，5株均未检出OXA-23-like、OXA-24-like及OXA-143-like基因；5株均检出NDM-1型基因。④在4株Nosocomialis不动杆菌中，4株均未检出OXA-23-like、OXA-24-like、OXA-58-like及OXA-143-like基因；3株检出NDM-1型基因。⑤该391株耐碳青霉烯类不动杆菌的其余金属β-内酰胺酶基因筛查结果均为阴性。2.①在2株携带NDM-1型基因的鲍曼不动杆菌中，1株检出OXA-23-like基因，均未检出其它碳青霉烯酶基因；2株均检出外膜孔蛋白carO基因，1株检出外膜孔蛋白oprD基因；2株均检出adeB、adeI、adeJ及adeK基因。②在5株携带NDM-1型基因的Pittii不动杆菌中，2株检出OXA-58-like基因，均未检出其它碳青霉烯酶基因；5株均检出外膜孔蛋白oprD基因，5株均未检出外膜孔蛋白carO基因；5株均检出外排泵adeI、adeK基因，4株检出adeJ基因，1株检出adeB基因。③在3株携带NDM-1型基因Nosocomialis不动杆菌中，均未检出其它碳青霉烯酶基因；3株均检出外膜孔蛋白carO、oprD基因；3株均检出外排泵adeB、adeI、adeJ及adeK基因。④以上10株携带NDM-1型基因的不动杆菌，均未检出外排泵调节基因adeS。⑤表达NDM-1、NDM-6及NDM-9酶的重组菌，对亚胺培南的MIC值分别为32、128和64μg/ml。3.福州市50株耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌可分为A~G七个型别，其中A、B、E和G型各1株，C型4株，D型7株，F型35株。5株Pittii不动杆菌和3株Nosocomialis不动杆菌可分为A和B两型。结论：1.福州市临床分离的耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗生素的耐药机制主要与产OXA-23-like碳青霉烯酶相关。2.第一次在耐碳青霉烯类Pittii不动杆菌中同时检出NDM-1型基因与OXA-58-like基因。2 福建医科大学硕士学位论文3.第一次在福建省内发现携带OXA-24-like、OXA-58-like和NDM-1型基因的耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌。4.NDM-1型基因阳性的Pittii不动杆菌对碳青霉烯类抗生素耐药主要可能是由外膜孔蛋白CarO缺失，AdeIJK外排泵及NDM-1酶共同作用的结果。而NDM-1型基因阳性的Nosocomialis不动杆菌与鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗生素耐药可能主要与AdeIJK外排泵及和NDM-1酶有关。5.NDM-1、NDM-6及NDM-9酶水解亚胺培南能力从强到弱依次为NDM-6、NDM-9和NDM-1酶。6.福州市流行的耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌的基因型为F型。在福建医科大学附属协和医院烧伤ICU和综合ICU流行的耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌的基因型不同，前者为D型，后者为F型。关键词：不动杆菌，碳青霉烯酶，耐药，基因分型3 福建医科大学硕士学位论文ResistanceMechanismsandMolecularEpidemiologyinCarbapenem-ResistantAcinetobacterspp.ClinicalIsolatesAbstractObjectives:1.ToinvestigatedtheroleofClassBandDcarbapenemasegenesinthegenerationofdrugresistanceincarbapenem-resistantAcinetobacterspp.clinicalisolatesinFuzhou.2.ToexploredtheroleofClassAcarbapenemases,outermembraneproteinsandeffluxpumpsinthecarbapenem-resistantAcinetobacterspp.clinicalisolatesproducingNewDelhimetallo-β-lactamase-1(NDM-1).3.Tostudiedtheimipenem-hydrolyzingcapabilityofNDM-1,NDM-6andNDM-9.4.Toexploredthemolecularepidemiologicalfeaturesofcarbapenem-resistantAcinetobacterspp.clinicalisolatesinFuzhou.Methods:1.Atotalof391strainsofcarbapenem-resistantAcinetobacterspp.werecollectedfromSeptember2010toAugust2014inFuzhou.Allstrainswereidentifiedandantimicrobialsusceptibilitytest(AST)ofthosestrainswereperformedbyVITEK-2compactsystemandthentheywereconfirmedtheirimipenemresistancewithKirby-Bauerantibiotictesting.AllAcinetobacterspp.isolateswereclassifiedby42℃growthexperiment,OXA-51-likegenedetectionandsequenceanalysisofrpoBgene.ClassBandDcarbapenemasegenesweredeterminedbyPCRassay.2.ThroughPCRassay,ClassAcarbapenemasegenes,effluxpumpgenesandoutermembraneproteingeneswerescreenedinAcinetobacterspp.isolatesthatcarriedNDM-1gene.ThepCR2.1vectorsthatcontainedNDM-1,NDM-6orNDM-9generespectivelywasconstructedandtransformedintotheTOP10competentcells.4 福建医科大学硕士学位论文TheMinimalinhibitoryconcentration(MIC)valuesofdifferenttypeofrecombinantbacteriaweredeterminedwithagardilutionmethod.3.The58clinicalisolatesofcarbapenem-resistantAcinetobacterspp.weretypedbyDiversiLabsystem,including50strainsofcarbapenem-resistantAcinetobacterbaumannii(CRAB)(39fromFujianMedicalUniversityUnionHospital,9strainsfromtheFirstAffiliatedHospitalofFujianMedicalUniversityand2strainsfromFuzhouGeneralHospitalofNanjingMilitaryCommand),5strainsofcarbapenem-resistantAcinetobacterpittiiand3strainsofcarbapenem-resistantAcinetobacternosocomialis(thelattertwotypeswerefromFujianMedicalUniversityUnionHospital).Results:1.①Amongthe391clinicalisolates,therewere382strainsofCRAB,5strainsofcarbapenem-resistantAcinetobacterpittiiand4strainsofcarbapenem-resistantAcinetobacternosocomialis.②Among382strainsofAcinetobacterbaumannii,93.46percent(357strains)carriedOXA-23-1ikegene,1.05percent(4strains)carriedOXA-24-1ikegene,0.52percent(2strains)carriedOXA-58-1ikegene;2strainscarriedNDM-1gene.③Among5strainsofAcinetobacterpittii,2strainscarriedOXA-58-1ikegene,nonestraincarriedOXA-23-like、OXA-24-likeorOXA-143-likegene;AllstrainscarriedNDM-1gene.④Among4strainsofAcinetobacternosocomialis,nonestraincarriedOXA-23-likegene、OXA-24-like、OXA-58-1ikeandOXA-143-likegene,3strainscarriedNDM-1gene.⑤Noothermetallo-β-lactamasegeneshadbeendetected.2.①Among2strainsofAcinetobacterbaumanniipositivewithNDM-1gene,1straincarriedOXA-23-likegeneandothercarbapenemaseswerenotdetected;2strainscarriedcarOgene,1straincarriedoprDgene;2strainscarriedadeBgene、adeIgene、adeJgeneandadeKgene.②Amongthe5strainsofAcinetobacterpittiipositivewithNDM-1gene,2straincarriedOXA-58-likegeneandothercarbapenemaseswerenotdetected;5straincarriedoprDgene,butcarOgenewasnotdetected;5strainscarriedadeIgeneandadeKgene,4strainscarriedadeJgene,and15 福建医科大学硕士学位论文straincarriedadeBgene.③Among3strainsofAcinetobacternosocomialispositivewithNDM-1gene,3strainscarriedcarO、oprD、adeB、adeI、adeJandadeKgene,butothercarbapenemaseswerenotdetected.④Alltheabove10strainspositivewithNDM-1genedidnotcarryadeSgene.⑤MICsofimipenemforEscherichiacoliTOP10expressingNDM-1,NDM-6andNDM-9wererespectively32,128and64µg/ml.3.The50strainsofAcinetobacterbaumanniiinFuzhouwereclassifiedinto7typesfromAtoG.TypeA,B,EandGeachhad1strain,typeChad4strains,typeDhad7strains,andtypeFhad35strains.The5strainsofAcinetobacterpittiiand3strainsofAcinetobacternosocomialiswereclassifiedintotypeAandtypeB.Conclusions:1.TheexistenceofOXA-23-likeenzymemaybethemainreasonthatCRABisolatesinFuzhouwereresistanttocarbapenem.2.Forthefirsttime,NDM-1geneandOXA-58-likegenewerebothdetectedincarbapenem-resistantAcinetobacterpittii.3.ForthefirsttimeinFujianprovincewerefoundtheCRABcarryingOXA-24-likegene,OXA-58-likegeneorNDM-1gene.4.In2strainsofAcinetobacterbaumannii,5strainsofAcinetobacterpittiiand3strainsofAcinetobacternosocomiali,wereallfoundNDM-1gene.ThecarbapenemresistanceofAcinetobacterpittiiwithNDM-1genewasprobablycausedbytheco-effectofeffluxpumpAdeIJKandNDM-1enzymeandthelackofCarO,whilethatofAcinetobacterNosocomialisandAcinetobacterbaumanniimightmainlybecausedbyco-effectofeffluxpumpAdeIJKandNDM-1enzyme.5.Asforthecapabilitytohydrolyzeimipenem,NDM-6enzymerankedtop,andNDM-9enzymeandNDM-1enzymefollowed.6.CRABisolatesoftypeFmightbethemajorepidemicstraininFuzhou.However,thoseinBurnICUofFujianMedicalUniversityUnionHospitalwasoftypeD,quitedifferentfromthoseF-typeCRABfromGeneralICU.Keywords:Acinetobacterspp,carbapenemase,resistance,genotype6 福建医科大学硕士学位论文本文缩略词缩略词英文全称中文全称ABAcinetobacterbaumannii鲍曼不动杆菌Acb复合Acinetobactercalcoaceticus-Acinetobacter醋酸钙不动杆菌-鲍曼不动杆体baumanniicomplex菌复合体AFLPAmplifiedfragmentlengthpolymorphism扩增片段长度多态性Carbapenem-resistantAcinetobacterCRAB耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌baumanniiCLSIClinicalLaboratoryStandardsInstitute美国临床实验室标准化研究所IPMImipenem亚胺培南低频限制性位点聚合酶链式反IRS-PCRInfrequent-restriction-sitePCR应MBLMetallo-β-lactamase金属β-内酰胺酶MICMinimalinhibitoryconcentration最低抑菌浓度MLSTMultilocussequencetyping多位点序列分型NDMNewDelhimetallo-β-lactamase新德里金属β-内酰胺酶OMPsOutermembraneproteins外膜孔蛋白OXAOxacillinase苯唑西林酶PBPsPenicillin-bindingproteins青霉素结合蛋白PCRPolymerasechainreaction聚合酶链式反应PFGEPulsedfieldgelelectrophoresis脉冲场凝胶电泳RAPDRandomamplifiedpolymorphicDNA随机扩增多态性DNAREP-PCRRepetitivesequence-basedPCR重复序列PCRRNDResistance-nodulation-divisionsuperfamily耐药结节分化超家族7 福建医科大学硕士学位论文前言不动杆菌属细菌是一群不发酵糖类，氧化酶阴性的革兰阴性球杆菌，属于条件致病菌。广泛分布于外界环境中，也存在于人体的皮肤、结膜、口腔、呼吸道、胃肠道及泌尿生殖道等部位。目前，在不动杆菌属中已发现超过40个基因种[1]，其中39个基因种已命名(http://www.bacterio.cict.fr/a/acinetobacter.html)。临床分离的绝大多数不动杆菌属细菌都是鲍曼不动杆菌（Acinetobacterbaumannii,AB），鲍曼不动杆菌有较强的抵抗力，在医院环境中可长期存在，其与Pittii不动杆菌、Nosocomialis不动杆菌和醋酸钙不动杆菌，统称为醋酸钙不动杆菌-鲍曼不动杆菌复合体（Acinetobactercalcoaceticus-Acinetobacterbaumanniicomplex，Acb复合体）[2-3]，前三者为不动杆菌属中引起医院内感染的常见多重耐药菌[4-6]，常引起泌尿道、呼吸道、创面伤口的感染及菌血症，重者威胁患者的生命。由于它们的致病力、耐药性和生化表型十分相似，临床上通过传统的生化试验和自动化细菌鉴定系统很难区分开来，故临床上常报告为检出Acb复合体或者检出鲍曼不动杆菌[7]。随着抗生素广泛应用所产生的选择性压力，目前不动杆菌属细菌对现有几乎所有种类的抗生素的敏感性呈现逐年下降趋势，有的地方已经报道出现全耐药的鲍曼不动杆菌。而碳青霉烯类抗生素作为新一代β-内酰胺类抗生素，对不动杆菌属细菌具有良好的抗菌作用，是治疗不动杆菌属细菌重症感染的首选抗生素。但自1991年美国报道首例碳青霉烯类耐药的鲍曼不动杆菌（Carbapenem-resistantAcinetobacterbaumannii，CRAB)以来，世界各地陆续出现此类菌株的报道。不动杆菌对耐碳青霉烯类抗生素的耐药机制相对复杂，主要包括：产碳青霉烯酶、外膜孔蛋白(Outermembraneproteins，OMPs)的表达缺失或下调、药物的主动外排泵系统活性增强和青霉素结合蛋白(Penicillin-bindingproteins，PBPs)的改变等[8-9]，而耐药性的产生通常是其中一种或者几种机制共同作用的结果。在这些耐药机制中，产碳青霉烯酶是最主要的耐药机制。碳青霉烯酶是指所有能水解碳青霉烯类的β-内酰内酰胺酶。依据Ambler分子分类将碳青霉烯酶分为三类：A类、B类和D类酶。在不动杆菌属中，水解碳青霉烯类抗生素的酶主要是B类酶和D类酶[9]，A类酶少见。8 福建医科大学硕士学位论文B类酶为金属β-内酰胺酶（Metallo-β-lactamase，MBL)，简称金属酶，对碳青霉烯类抗生素的水解活性是D类酶的100到1000倍[10]。在不动杆菌中研究较多的MBL有IMP、VIM、SIM、NDM。其中1型新德里金属β-内酰胺酶（NewDelhimetallo-β-lactamase-1，NDM-1)自2009年报道以来，已在国内外多个国家的CRAB中发现[11-13]。D类酶，即苯唑西林酶（Oxacillinase，OXA），按同源性可分为12组，在不动杆菌属中发现了6个组，分别以OXA-23、OXA-24、OXA-51、OXA-58、OXA-143、OXA-48为代表[14]。前四类国内外研究报道的比较多。产OXA-23类酶已被认为是导致世界各地许多国家出现CRAB的主要原因[15-16]，OXA-143类酶是2009年第一次在鲍曼不动杆菌中发现，OXA-48类酶是近年才在鲍曼不动杆菌中发现。不动杆菌具有脂质双层的外膜，OMPs以双分子层形式存在于外膜上。它可以通过调控其基因表达或者结构变化来逃避抗生素的作用，导致临床治疗无效。对OMPs的研究主要集中在CarO蛋白与OprD蛋白。有研究认为CarO蛋白并不抗生素对是鲍曼不动杆菌作用的特异性离子通道，而可能是非特异性通道[17]，而OprD蛋白可以提高细菌对β-内酰胺类抗生素的适应性[18]，但也有研究表明，仅仅是OprD蛋白的缺失不足以导致鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗生素最低抑菌浓度（Minimalinhibitoryconcentration，MIC）的增加[19]。主动外排泵系统是一些细菌天然耐药或获得性多重耐药的重要原因，迄今发现的与碳青霉烯类耐药相关主动外排泵主要是耐药结节分化超家族(Resistance-nodulation-divisionsuperfamily，RND)的AdeABC外排泵。研究证实，AdeABC外排泵过度表达可导致鲍曼不动杆菌对β-内酰胺类、氨基糖苷类及氟喹诺酮类抗生素耐药，也包括对碳青霉烯类的耐药[20]。在不动杆菌耐药机制研究中，关于PBPs的改变导致耐药产生的研究相对少见。已知研究表明，PBPs介导的鲍曼不动杆菌产生耐药机制主要是由于PBPs编码基因突变产生了一个与β-内酰胺类抗生素亲和力低的新的PBPs，其次是原有的PBPs表达量下降[21]。然而，也有研究表明仅仅是PBPs的改变，还不足以直接导致鲍曼不动杆菌对抗生素的耐药，更有可能是PBPs连同其它耐药机制共同作用导致鲍曼不动杆菌耐药株的产生[22]。随着CRAB日趋增多，很容易通过交叉感染在医院内、医院间传播，有些9 福建医科大学硕士学位论文耐药株甚至在国内和国家间爆发流行，包括中国的大陆、香港和台湾[11,23-24]。因此控制耐药不动杆菌的传播，及早和准确地发现耐药菌株来源和传播方式，掌握其分子流行病学，就具有重要意义。目前，用于不动杆菌的分型方法较多，重复序列PCR（Repetitivesequence-basedPCR，REP-PCR）是其中一种技术[25]。基于REP-PCR原理的DiversiLab分型系统操作方便快速，重复性好，分辨率较高，适合于大批量菌株的鉴定[26-27]且其分型结果与脉冲场凝胶电泳（Pulsedfieldgelelectrophoresis，PFGE）有较好的一致性[28]，已成为医院感染分子流行病学研究的理想方法之一。本研究收集2010年9月~2014年8月福州市临床分离的Acb复合体391株，通过42℃生长、OXA-51-like基因检测和rpoB基因测序进行菌种鉴定，PCR法筛查碳青霉烯酶基因，包括B类MBL基因(NDM-like、VIM-like、IMP-like、SIM-1、GIM-1和SPM)和D类OXA型基因（OXA-23-like、OXA-24-like、OXA-58-like和OXA-143-like）。并进一步探讨A类碳青霉烯酶基因（SHV、TEM、CTX-M-1群、CTX-M-2群、CTX-M-8群、CTX-M-9群、CTX-M-25群）、OMPs基因及外排泵基因在NDM-1型基因阳性菌株中的作用。通过转化实验，分析携带有NDM-1型基因、NDM-6型基因和NDM-9型基因的重组菌对抗生素的耐药差别。最后利用DiversiLab细菌DNA指纹图谱分析系统对50株CRAB、5株Nosocomialis不动杆菌和3株Pittii不动杆菌分型，了解以上细菌在福州市的流行情况。10 福建医科大学硕士学位论文第一部分耐碳青霉烯类不动杆菌的碳青霉烯酶基因研究1材料和方法1.1材料1.1.1菌株来源收集福州市4家医院2010年9月~2014年8月临床分离的391株非重复的对亚胺培南耐药的Acb复合体，其中福建医科大学附属协和医院327株、福建医科大学附属第一医院22株、南京军区福州总医院22株和福建省立医院20株，标本类型有痰、尿液、血液和胸腹水等。全部菌株经VITEK-2compact全自动微生物分析仪进行菌种鉴定和药敏试验。药敏结果根据美国临床实验室标准化研究所（ClinicalLaboratoryStandardsInstitute,CLSI）2014年版的抗菌药物敏感性试验标准来判断。质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922。1.1.2主要试剂（1）革兰阴性细菌鉴定卡(GN)、药敏卡片(AST-GN16)：法国生物梅里埃公司；（2）亚胺培南纸片(10µg)：杭州天和微生物试剂有限公司；（2）100bpDNALadder、TaqDNA聚合酶(2.5U/μl)、dNTP(2.5mmol/L)、6×Loading缓冲液、电泳用琼脂糖：北京天根生化科技有限公司；（3）25×TAE缓冲液：在烧杯中加入60.05gTris、14.0ml冰乙酸和9.3gEDTA·2Na，加入300ml去离子水搅拌混匀，用去离子水定容至500ml，室温保存，使用时稀释至1×TAE。（4）引物的合成及PCR产物测序：上海博尚生物技术有限公司。1.1.3Mueller-Hinton（M-H）培养基称取15.2gMueller-Hinton(M-H)琼脂粉（英国Oxoid公司），溶于400ml去离子中，高压蒸汽灭菌，121℃高压20min，待温度降至50℃左右，用灭菌量筒量取25mlM-H琼脂液倒入无菌空平板中（直径9cm），置室温下冷却，凝固。1.1.4主要仪器（1）LRH-250F生化培养箱：上海一恒科技有限公司；11 福建医科大学硕士学位论文（2）BSC-1360ⅡB2生物安全柜：北京东联哈尔仪器厂；（3）VITEK-2compact全自动微生物分析仪：法国生物梅里埃公司；（4）MK-10干式恒温加热器：杭州奥盛仪器有限公司；（5）5424R型台式高速冷冻离心机：德国Eppendorf公司；（6）ND-1000微量紫外可见分光光度计：美国NanoDrop公司；（7）Veriti96孔梯度PCR扩增仪：美国AppliedBiosystems公司；（8）DYY-2稳压温流电泳仪：北京市六一仪器厂；（9）UniversalHoodⅡ凝胶成像分析系统：美国BIO-RAD公司。1.2方法1.2.1菌株鉴定及药敏1.2.1.1Acb复合体鉴定及药敏391株Acb复合体经VITEK-2compact全自动微生物分析仪进行鉴定和药敏试验，为均对亚胺培南耐药的Acb复合体。1.2.1.2对亚胺培南耐药性的验证K-B纸片扩散法：将0.5麦氏浊度单位的待检菌株涂布于M-H琼脂平板上，中间贴亚胺培南(10µg)纸片，置35℃培养18~24h，以大肠埃希菌ATCC25922为质控菌株。药敏结果根据2014年CLSI的抗菌药物敏感性试验标准进行判断。1.2.1.3Abc复合体具体菌种的鉴定Acb复合体包括醋酸钙不动杆菌、鲍曼不动杆菌、Nosocomialis不动杆菌，和Pittii不动杆菌，通过42℃生长实验及PCR法筛查OXA-51-like基因与rpoB基因序列分析可将其区分开来，菌种鉴定的简略图见图1.1。1.2.1.3.142℃生长与氧化-发酵试验将菌株分别接种于克氏双糖铁琼脂培养基和氧化-发酵的微量生化反应管中，前者置42℃培养16~20h，后者置35℃培养16~20h。以实验室保存的鲍曼不动杆菌作为42℃生长和氧化-发酵试验为氧化型的质控菌株，以实验室保存的洛菲不动杆菌作为42℃不生长的质控菌株，以大肠埃希菌ATCC25922作为氧化-发酵试验为发酵型的质控菌株。Acb复合体氧化-发酵试验应为氧化型，除醋酸钙不动杆菌外，其他三个菌种42℃均会生长。12 福建医科大学硕士学位论文图1.1Abc复合体的菌种鉴定1.2.1.3.2细菌DNA模板的提取煮沸法提取细菌DNA模板：挑取单个菌株接种于M-H琼脂平板上，35℃培养16~20h，用一次性接种环挑取若干菌落于装有350μl灭菌水的无菌EP管中，100℃煮沸10min。6000rpm离心8min，提取上清，即为模板DNA，测其浓度，并稀释至50-100ng/μl，置-20℃冰箱保存。1.2.1.3.3鲍曼不动杆菌的鉴定OXA-51-like基因为鲍曼不动杆菌天然存在的基因，而不存在不动杆菌属的其它基因种细菌中[29]。故PCR扩增OXA-51-like基因，可将Acb复合体分为鲍曼不动杆菌和非鲍曼不动杆菌，PCR扩增OXA-51-like基因产物，经1％琼脂糖凝胶电泳，使用凝胶成像分析系统观察条带大小与预期是否一致，并将阳性结果送上海博尚生物技术有限公司测序，测序结果通过BLAST与Genbank中的序列进行比对，确定是否为OXA-51-like基因序列。PCR扩增反应参数为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，循环30次；最后72℃延伸10min。OXA-51-like基因引物序列见表1.1，体系见表1.2。13 福建医科大学硕士学位论文表1.1不动杆菌菌种鉴定及碳青霉烯酶基因扩增引物基因名称引物序列预计产物参考（5'-3'）长度（bp）文献rpoB上游：TA(C/T)CG(C/T)AAAGA(C/T)TTGAAAGAAG901[30]下游：CG(G/C/T)GC(A/G)TGCAT(C/T)TTGTC(A/G)TOXA-23-like上游：GATCGGATTGGAGAACCAGA501[31]下游：ATTTCTGACCGCATTTCCATOXA-24-like上游：GGTTAGTTGGCCCCCTTAAA246[31]下游：AGTTGAGCGAAAAGGGGATTOXA-51-like上游：TAATGCTTTGATCGGCCTTG353[32]下游：TGGATTGCACTTCATCTTGGOXA-58-like上游：AAGTATTGGGGCTTGTGCTG599[31]下游：CCCCTCTGCGCTCTACATACOXA-143-like上游：TGGCACTTTCAGCAGTTCCT149[33]下游：TAATCTTGAGGGGGCCAACCIMP-like上游：GAATAG(A/G)(A/G)TGGCTTAA(C/T)TCTC188[34]下游：CCAAAC(C/T)ACTA(G/C)GTTATCVIM-like上游：GTTTGGTCGCATATCGCAAC382[34]下游：AATGCGCAGCACCAGGATAGSIM-1上游：GTACAAGGGATTCGGCATCG569[34]下游：TGGCCTGTTCCCATGTGAGGIM-1上游：TCAATTAGCTCTTGGGCTGAC72[34]下游：CGGAACGACCATTTGAATGGSPM上游：CTAAATCGAGAGCCCTGCTTG798[34]下游：CCTTTTCCGCGACCTTGATCNDM-like上游：TCCTCAACTGGATCAAGCAGG249本文下游：AAAATACCTTGAGCGGGCCANDM-full上游：ATGGAATTGCCCAATATTATGCAC813[35]下游：TCAGCGCAGCTTGTCGGCPre-NDM-full上游：CACCTCATGTTTGAATTCGCC984[36]下游：CTCTGTCACATCGAAATCGC1.2.1.3.4Pittii不动杆菌和Nosocomialis不动杆菌的鉴定上述42℃生长且OXA-51-like基因阴性的细菌可能为Pittii不动杆菌或Nosocomialis不动杆菌。为了区分以上细菌，采用PCR法扩增rpoB基因并测序进行菌种鉴定。扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像分析系统观察结果，并将产物送上海博尚生物技术有限公司测序，测序结果通过BLAST与Genbank中的序列进行比对，基因匹配度≥98%且最高者可认为为该菌种[30,37]。PCR扩增rpoB基因引物序列见表1.1，体系及条件与OXA-51-like基因检测相同。14 福建医科大学硕士学位论文表1.2PCR反应体系（总反应体系25μl）名称体积基因组DNA1上游引物(10μmmol/L)0.5下游引物(10μmmol/L)0.510×Taq缓冲液2.5dNTP(2.5mmol/L)2Taq聚合酶(2.5U/μl)0.5ddH2O181.2.2碳青霉烯酶基因检测及测序PCR法检测Acb复合体的碳青霉烯酶基因，包括B类MBL基因(NDM-like、IMP-like、VIM-like、SIM-1、GIM-1和SPM)和D类OXA型基因（OXA-23-like、OXA-24-like、OXA-58-like和OXA-143-like），引物序列见表1.1。扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，使用凝胶成像分析系统观察条带大小与预期是否一致，并将阳性结果送上海博尚生物技术有限公司测序，测序结果通过BLAST与Genbank中的序列进行比对分析。NDM-like基因阳性的标本再用NDM-full引物扩增NDM型基因全长，PCR产物送上海博尚生物技术有限公司测序，测序结果通过BLAST与Genbank中的序列进行比对分析，确定NDM基因型别。2结果2.1Acb复合体的菌种鉴定结果2.1.142℃培养与氧化-发酵实验391株Acb复合体42℃培养均生长且均为氧化型细菌。2.1.2鲍曼不动杆菌的鉴定391株Acb复合体中，382（97.70%）株OXA-51-like基因筛查为阳性，且电泳条带大小与预期结果一致，均为单一条带。通过测序结果与Genbank中的序列进行比对分析，确定均为OXA-51-like基因序列。因此，可认为，该382株Acb复合体为鲍曼不动杆菌，见图1.2。15 福建医科大学硕士学位论文2.1.3Pittii不动杆菌和Nosocomialis不动杆菌的鉴定391株Acb复合体中，9株未检测到OXA-51-like基因，PCR扩增rpoB基因，电泳条带大小与预期结果一致，均为单一条带，通过测序并与Genbank中的序列进行比对分析可知，5株为Pittii不动杆菌，4株为Nosocomialis不动杆菌，见图1.2。百10097.70分比90（80%）706050403020101.281.020鲍曼不动杆菌Pittii不动杆菌Nosocomialis不动杆菌（382株）（5株）（4株）图1.2391株Acb复合体的菌种鉴定结果2.2Acb复合体的药敏试验结果本次收集391株Acb复合体（382株鲍曼不动杆菌、5株Pittii不动杆菌和4株Nosocomialis不动杆菌）经VITEK-2compact全自动微生物分析仪药敏试验均对亚胺培南耐药。经K-B法验证所有菌株均对亚胺培南耐药。382株鲍曼不动杆菌对亚胺培南和美罗培南的耐药率均是100％，对其它测定的8种抗生素氨曲南、哌拉西林/他唑巴坦、头孢他啶、头孢吡肟、庆大霉素、妥布霉素、环丙沙星的耐药率均大于80%。具体药敏结果见表1.3。5株Pittii不动杆菌表现为对亚胺培南、美罗培南、头孢他啶和头孢吡肟均耐药。1株对环丙沙星和庆大霉素敏感，2株对左氧氟沙星敏感，4株对妥布霉素敏感，具体药敏结果见表1.3。4株Nosocomialis不动杆菌均对亚胺培南、美罗培南、头孢他啶、头孢吡肟和庆大霉素耐药，2株对哌拉西林/他唑巴坦敏感，3株对妥布霉素、环丙沙星和16 福建医科大学硕士学位论文左氧氟沙星敏感，具体药敏结果见表1.3。表1.3391株Acb复合体对部分抗菌药物的药敏结果抗菌药物鲍曼不动杆菌Pittii不动杆菌Nosocomialis不动(n=382)(n=5)杆菌(n=4)S（%）I（%）R(%)SIRSIR亚胺培南0.000.00100.000/50/55/50/40/44/4美罗培南0.000.00100.000/50/55/50/40/44/4氨曲南0.000.5899.420/51/5b4/50/41/43/4哌拉西林/他唑巴坦1.05a2.6396.320/54/51/52/41/41/4头孢他啶0.260.7998.950/50/55/50/40/44/4头孢吡肟0.790.5498.670/50/55/50/40/44/4庆大霉素8.663.6787.671/51/53/50/40/44/4妥布霉素19.610.0080.394/50/51/53/40/41/4环丙沙星1.390.0098.611/51/53/53/40/41/4左氧氟沙星7.338.6484.032/52/51/53/40/41/4注：S表示敏感，I表示中介，R表示耐药；鲍曼不动杆菌的药敏结果以百分比表示，如a：1.05表示382株鲍曼不动杆菌中有1.05%的菌株对哌拉西林/他唑巴坦敏感；Pittii不动杆菌和Nosocomialis不动杆菌的药敏结果以绝对值表示，如b:1/5表示5株Pittii不动杆菌中氨曲南的药敏结果为中介的菌株有1株。2.3碳青霉烯酶基因检测与测序结果382株鲍曼不动杆菌中，357株（93.46%）OXA-23-like基因阳性，4株（1.05%）OXA-24-like基因阳性且OXA-23-like基因全为阴性，2株（0.52%）OXA-58-like基因阳性且OXA-23-like基因同时阳性。以上PCR产物经电泳，条带大小与预期结果一致且均为单一条带，通过测序并与Genbank中的序列进行比对验证，结果符合。未检测出OXA-143-like基因。具体结果见表1.4。OXA-24-like与OXA-58-like基因检测电泳结果见图1.3。NDM-1型基因检测电泳结果见图1.4。OXA-24-like与OXA-58-like基因部分测序序列见图1.5和图1.6。在2株鲍曼不动杆菌中检出NDM-like基因，扩增产物条带与预期结果一致且17 福建医科大学硕士学位论文为单一条带，通过测序并与Genbank中的序列进行比对验证，均为NDM-like基因。PCR法扩增该2株鲍曼不动杆菌的NDM型基因全长，通过测序并与Genbank中的序列进行比对，发现与NDM-1型基因序列完全一致，认为该2株鲍曼不动杆菌携带NDM-1型基因，其余MBL基因SIM-1、VIM-like、SPM、GIM-1和IMP-like筛查均为阴性，结果见表1.4。NDM-1型基因部分测序序列见图1.7。5株Pittii不动杆菌中2株携带OXA-58-like基因，其余OXA型基因OXA-23-like、OXA-24-like及OXA-143-like基因筛查均为阴性。5株Pittii不动杆菌均携带NDM-1型基因，其余金属β-内酰胺酶基因SIM-1、VIM-like、SPM、GIM-1和IMP-like筛查均为阴性，结果见表1.4。4株Nosocomialis不动杆菌中均未检测出OXA-23-like、OXA-24-like、OXA-58-like及OXA-143-like基因，其中在3株耐药菌中检出NDM-1型基因，其余金属β-内酰胺酶基因SIM-1、VIM-like、SPM、GIM-1和IMP-like筛查均为阴性，结果见表1.4。表1.4391株Acb复合体的B和D类碳青霉烯酶基因检测结果菌种OXA-OXA-OXA-OXA-IMP-VIM-SIMGIMSPMNDM23-24-58-143-llikelike-1-1-1likelikelikeike鲍曼不动杆357/3824/3822/3820/3820/3820/3820/3820/3820/3822/382菌(n=382)Pittii不动杆菌0/50/52/50/50/50/50/50/50/55/5(n=5)Nosocomialis不动杆菌0/40/40/40/40/40/40/40/40/43/4(n=4)总计357/3914/3914/3910/3910/3910/3910/3910/3910/39110/391（n=391）18 福建医科大学硕士学位论文图1.3OXA-24-like与OXA-58-like基因检测结果注：M为100bpDNALadder；N为阴性对照；561、562、602和617号为携带OXA-24-like基因菌株；355、449、609和625号为携带OXA-58-like基因菌株图1.4Acb复合体的NDM-1基因检测结果注：M为100bpDNALadder；N为阴性对照；C14和C50号为鲍曼不动杆菌；A605、606、609、625和640号为Pittii不动杆菌；A607、611和615号为Nosocomialis不动杆菌19 福建医科大学硕士学位论文图1.5OXA-24-like基因测序部分序列图1.6OXA-58-like基因测序部分序列图1.7NDM-1型基因测序部分序列20 福建医科大学硕士学位论文3讨论鲍曼不动杆菌有较强的抵抗力，是引起医院感染的常见病原菌之一。随着碳青霉烯类抗生素的滥用，使得CRAB越来越多，给临床治疗带来了巨大的挑战。本次实验研究382株CRAB的药敏情况，显示对氨曲南、哌拉西林/他唑巴坦、头孢他啶、头孢吡肟、庆大霉素、妥布霉素、环丙沙星的敏感性均低于20%，这意味着CRAB中存在着其它耐药机制导致其对氨基糖苷类与喹诺酮类抗生素耐药，其为多重耐药菌甚至是泛耐药菌，该药敏结果与国内外其它学者研究结果相似[38-42]。5株Pittii不动杆菌和4株Nosocomialis不动杆菌均表现为对亚胺培南、美罗培南、头孢他啶和头孢吡肟耐药。但对喹诺酮类抗生素如环丙沙星和左氧氟沙星、氨基糖苷类抗生素如妥布霉素的敏感性均明显高于鲍曼不动杆菌，与国外报道结果相似[41]。而临床上喹诺酮类抗生素可用于不动杆菌属感染的治疗[43]，氨基糖苷类抗生素可与β-内酰胺类抗生素联合使用用以治疗临床革兰阴性菌所致的感染[44]，因此，临床上用药可以根据实际的药敏结果，选取合适的药物进行治疗。不动杆菌对碳青霉烯类抗生素耐药最主要的机制产生了碳青霉烯酶[45-47]，其中主要是B类酶和D类酶。D类碳青霉烯酶在不动杆菌中发现了6个组，分别为OXA-23-like类、OXA-24-like类、OXA-51-like类、OXA-58-like类、OXA-143-like类和OXA-48-like类[14]。据文献报道，OXA-23-like基因已在世界许多国家的CRAB中检出，是产生CRAB的主要原因之一[48-50]。OXA-51-like基因已证实天然存在于鲍曼不动杆菌中，已成为鉴定鲍曼不动杆菌的重要依据。OXA-51-like基因虽然是D类碳青霉烯酶基因，但仅仅存在OXA-51-like基因是很难对碳青霉烯类抗生素产生耐药性[51]。携带OXA-24-like与OXA-58-like基因的CRAB主要在一些欧洲国家引起爆发流行，如西班牙、法国、比利时、意大利和希腊[52-57]。国内虽有报道携带OXA-24-like与OXA-58-like基因的不动杆菌，但大多为散在发现[40,51,58]。OXA-143-like和OXA-48-like基因是最近些年才在鲍曼不动杆菌中发现[16,59]，目前报道的不多。本次研究中，382株CRAB中OXA-23-like基因阳性率为93.46%，说明携带OXA-23-like基因是福州市产生CRAB的主要原因，这与国内报道的21 福建医科大学硕士学位论文CRAB耐碳青霉烯类抗生素为主要产OXA-23-like基因结果相一致[58,60-62]。OXA-24-like基因阳性和OXA-58-like基因阳性均为4株，例数较少，但此前尚未在福建省发现，本次研究是第一次在福建省发现携带OXA-24-like和OXA-58-like基因的菌株。同时，在2株携带有OXA-58-like基因的CRAB中，发现其OXA-23-like基因也为阳性，这在国内外并不常见。NDM-1型基因是一种MBL基因，自2009年首次发现并报道以来[63]，携带该型基因的细菌很快在世界各地播散开来，在加拿大、德国、日本、西班牙、英国、美国、瑞士、澳大利亚等国家均有发现报道[64]。在我国，自2011年首次报道产NDM-1型基因鲍曼不动杆菌以来[65]，在全国各地相继报道产NDM-1型基因细菌[66-68]。本次研究中发现2株携带NDM-1型基因，其中一株同时携带OXA-23-like基因，提示NDM型基因已在福州市出现，此前尚未报道在福建省发现携带NDM-1型基因的鲍曼不动杆菌，应引起我们足够的重视。目前文献报道在Pittii不动杆菌中发现了OXA-23-like、OXA-24-like、OXA-58-like与OXA-143-like基因[69-71]，在Nosocomialis不动杆菌中目前只发现携带有OXA-23-like与OXA-58-like基因[71-72]，未见其它OXA型酶基因的报道。而国内外关于在Pittii不动杆菌和Nosocomialis不动杆菌中检出MBL基因的报道相对较少见，本次实验除在5株Pittii不动杆菌中检出NDM-1型基因，且有2株还同时携带有OXA-58-like基因。虽然文献已报道有在Pittii不动杆菌中单独检出NDM-1型基因[73-75]或者检出OXA-58-like基因的报道[76-77]，但未见Pittii不动杆菌同时检出NDM-1型基因和OXA-58-like基因的报道，本研究是首次报道在耐碳青霉烯类Pittii不动杆菌中同时检出NDM-1基因和OXA-58-like基因。NDM-1型基因和OXA-58-like基因均已证实可使细菌对碳青霉烯类抗生素敏感性的下降[77-79]，提示在以上2株Pittii不动杆菌中可能存在NDM-1型与OXA-58-like类酶协同作用导致对碳青霉烯类抗生素耐药。同时，本次实验还在3株Nosocomialis不动杆菌中检出NDM-1型基因，除此之外，未发现其它碳青霉烯酶基因，提示该3株Nosocomialis不动杆菌对碳青霉烯类抗生素耐药主要与产生NDM-1有关。本次研究发现的10株NDM-1型基因阳性不动杆菌（2株鲍曼不动杆菌，5株Pittii不动杆菌和3株Nosocomialis不动杆菌）均来自福建医科大学附属协22 福建医科大学硕士学位论文和医院，而未在其他医院的被测菌株中发现。由于NDM-1型基因多存在质粒上，可使得NDM-1型基因容易在细菌间快速传播[80-81]，这提示NDM-1型基因可能在院内鲍曼不动杆菌，Nosocomialis不动杆菌和Pittii不动杆菌之间，甚至在不动杆菌与其他细菌间传播。碳青霉烯类抗生素对不动杆菌有良好的抗菌作用，是临床上治疗不动杆菌重症感染的首选抗生素，一旦出现对碳青霉烯类耐药，临床治疗将会变得十分困难，病死率较高。因此早期发现耐碳青霉烯类不动杆菌的耐药机制，进行有效的治疗隔离措施，才能较好的控制耐药性的传播，保障患者的生命健康。23 福建医科大学硕士学位论文第二部分携带NDM-1型基因的不动杆菌耐药机制研究1材料和方法1.1材料1.1.1菌株来源收集福建医科大学附属协和医院2013年9月~2014年8月临床分离的10株非重复的对亚胺培南耐药的含NDM-1型基因Acb复合体，菌株来源于医院的血液科、重症医学科、ICU、呼吸内科和小儿科。全部菌株VITEK-2compact全自动微生物分析仪，进行菌种鉴定和药敏试验，对亚胺培南均耐药。质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922。1.1.2主要试剂（1）革兰阴性细菌鉴定卡（GN）、药敏卡片（AST-GN16）、亚胺培南和MBL（IP/IPI）Etest试纸条：法国生物梅里埃公司；（2）100bpDNALadder、TaqDNA聚合酶(2.5U/μl)、dNTP(2.5mmol/L)、6×Loading缓冲液、电泳用琼脂糖、DNA纯化回收试剂盒、X-gal及TOP10感受态细胞：北京天根生化科技有限公司；（3）pCR2.1载体(25ng/μl)：美国Invitrogen生命技术公司；（4）亚胺培南：杭州默沙东制药有限公司；（5）TAE缓冲液：配制见本研究第一部分；（6）引物的合成及PCR产物测序：上海博尚生物技术有限公司。1.1.3培养基1.1.3.1M-H培养基配制见本研究第一部分。1.1.3.2含亚胺培南的琼脂平板将已倍比稀释的不同质量的亚胺培南溶液分别加入已高压蒸汽灭菌且温度降至45~50℃中的M-H琼脂液中，充分混匀，用灭菌量筒，量取25mlM-H琼脂液倒入无菌空平板中（直径9cm），置室温下冷却，凝固。1.1.3.3蓝白筛选M-H平板（含100µg/ml氨苄西林及80μl的20mg/ml的X-gal）24 福建医科大学硕士学位论文即每块4mm厚9cm宽的M-H平板应含有2.5mg氨苄西林。称取0.05g氨苄西林粉末，溶于0.5ml的ddH2O中，即浓度为0.1mg/μl。往M-H平板内加入25μl的0.1mg/μl氨苄西林溶液。将平板置于室温下约2h后，加入80μl的20mg/ml的X-gal，用无菌玻璃棒均匀涂抹开来，置室温下1~2h后使用。1.1.4主要仪器（1）LRH-250F生化培养箱：上海一恒科技有限公司；（2）BSC-1360ⅡB2生物安全柜：北京东联哈尔仪器厂；（3）VITEK-2compact全自动微生物分析仪：法国生物梅里埃公司；（4）MK-10干式恒温加热器：杭州奥盛仪器有限公司；（5）5424R型台式高速冷冻离心机：德国Eppendorf公司；（6）ND-1000微量紫外可见分光光度计：美国NanoDrop公司；（7）Veriti96孔梯度PCR扩增仪：美国AppliedBiosystems公司；（8）DYY-2稳压温流电泳仪：北京市六一仪器厂；（9）UniversalHoodⅡ凝胶成像分析系统：美国BIO-RAD公司。1.2方法1.2.1菌株鉴定、药敏试验（鉴定卡及Etest）及NDM-1型基因检测1.2.1.1菌株鉴定具体见本研究第一部分。1.2.1.2药物敏感实验1.2.1.2.1使用革兰阴性细菌药敏卡片（AST-GN16）进行药物敏感实验具体见本研究第一部分。1.2.1.2.2Etest法检测NDM-1型基因阳性不动杆菌对亚胺培南的药物敏感性将0.5麦氏浊度单位的待测菌用无菌棉拭子涂布于M-H琼脂平板上，平板置室温下干燥5min。用无菌镊子夹取亚胺培南Etest纸片贴于平板中央，置35℃培养16~20h，观看结果。以大肠埃希菌ATCC25922作为质控菌株。药敏结果根据2014年CLSI抗菌药物敏感性试验标准进行判断。1.2.1.3NDM-1型基因检测具体见本研究第一部分。1.2.2金属酶表型筛选试验25 福建医科大学硕士学位论文MBL（IP/IPI）Etest法：实验过程严格按照产品说明书进行。将0.5麦氏浊度单位的待测菌用无菌棉拭子涂布于M-H琼脂平板上，平板置室温下干燥5min。用无菌镊子夹取EtestMBL纸片贴于平板中央，置35℃培养16~20h，观看结果。以大肠埃希菌ATCC25922作为阴性质控菌株，以实验室保存的金属酶阳性的鲍曼不动杆菌作为阳性质控菌株。结果按照产品说明书判定：以单药与复合制剂的比值大于等于8，即IP/IPI≥8，或IP/IPI之间出现幻影圈，又或者IP与IPI中一项出现畸变圈，均判为金属酶表型筛选试验阳性。1.2.3A类碳青霉烯酶基因检测利用PCR法检测A类碳青霉烯酶基因，包括SHV、TEM、CTX-M-1群、CTX-M-2群、CTX-M-8群、CTX-M-9群和CTX-M-25群。扩增模板制备见第一部分，引物序列见表2.1。PCR扩增体系和条件与扩增OXA-51-like基因相同。阳性产物送上海博尚生物技术有限公司测序，测序结果与Genebank序列比对。表2.1A类碳青霉烯酶基因检测引物基因名称引物序列预计产物参考文献（5'-3'）长度（bp）SHV上游：AGGATTGACTGCCTTTTTG393[82]下游：ATTTGCTGATTTCGCTCGTEM上游：ATGAGTATTCAACATTTCCG858[83]下游：CCAATGCTTAATCAGTGAGGCTX-M-1群上游：GGTTTAAAAAATCACTGCGTC833[84]下游：TTGGTGACGATTTTAGCCGCCTX-M-2群上游：ATGATGACTCAGAGCATTCG865[85]下游：TGGGTTACGATTTTCGCCGCCTX-M-8群上游：ATGATAGAGACATCGCGTTAAG860[86]下游：CGGTGACGATTTTCGCGGCAGCTX-M-9群上游：ATGGTGACAAAGAGAGTGCA863[85]下游：CCCTTCGGCGATGATTCTCCTX-M-25群上游：CACACGAATTGAATGTTCAG923[87]下游：TCACTCCACATGGTGAGT1.2.4OMPs基因检测利用PCR法检测OMPs基因，包括carO基因和oprD基因。引物序列见表26 福建医科大学硕士学位论文2.2。PCR扩增体系和条件与扩增OXA-51-like基因相同。阳性产物送上海博尚生物技术有限公司测序，测序结果与Genebank中的序列比对。1.2.5外排泵基因检测利用PCR法检测外排泵AdeABC与AdeIJK的结构基因，包括adeB、adeI、adeJ、adeK基因和adeS调节基因，引物序列见表2.2。PCR扩增体系和条件与扩增OXA-51-like基因相同。阳性产物送上海博尚生物技术有限公司测序，测序结果与Genebank中的序列比对。表2.2OMPs基因和外排泵基因检测引物基因名称引物序列预计产物参考文献（5'-3'）长度（bp）carO上游：TGACAACTACAGCTTTACTTGC690[88]下游：CAACTGGCAACCATTTGToprD上游：TTGTTGAAGATGCGAACGGT921本文下游：TCGTGGTTACCGATGAAATCAGadeB上游：CTTGCATTTACGTGTGGTGT168[89]下游：GCTTTTCTACTGCACCCAAAadeI上游：CAAATGCAAATGTAGATCTTGG210[89]下游：AAACTGCCTTTACTTAGTTGadeJ上游：GGTCATTAATATCTTTGGC221[89]下游：GGTACGAATACCGCTGTCAadeK上游：TTGATAGTTACTTGACTGTTC162[89]下游：GGTTGGTGAACCACTGTATCadeS上游：TTAGTTATTCATAGAAATTTT1072[89]下游：ATGAAAAGTAAGTTAGGAAT1.2.6NDM-1、NDM-6及NDM-9酶水解亚胺培南能力的比较1.2.6.1实验分组：本部分实验分为8组，具体见表2.3。1.2.6.2NDM-1、NDM-6及NDM-9型基因的扩增携带NDM-6及NDM-9型基因的菌株来源于本实验室保存的菌株。分别扩增含与不含基因启动子序列的NDM-1、NDM-6及NDM-9型基因全长，引物分别为Pre-NDM-full与NDM-full，引物序列见表1.1，PCR反应体系及条件与OXA-51-like基因检测相同。1.2.6.3PCR产物的纯化PCR产物经1％琼脂糖凝胶进行电泳，110V电泳30min，用凝胶成像分析27 福建医科大学硕士学位论文表2.3NDM-1、NDM-6及NDM-9酶水解亚胺培南能力的比较试验分组情况组号菌株解释1TOP10TOP10感受态细胞2TOP10+pCR2.1含空载体的重组菌3TOP10+pCR2.1+NDM-1含NDM-1全长基因的重组菌4TOP10+pCR2.1+NDM-6含NDM-6全长基因的重组菌5TOP10+pCR2.1+NDM-9含NDM-9全长基因的重组菌6TOP10+pCR2.1+Pre-NDM-1含启动子和NDM-1全长基因的重组菌7TOP10+pCR2.1+Pre-NDM-6含启动子和NDM-6全长基因的重组菌8TOP10+pCR2.1+Pre-NDM-9含启动子和NDM-9全长基因的重组菌系统结果观察，确定为单一条带。具体纯化步骤如下：（1）向吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中），加入500μl的平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉收集管中废液，将吸附柱放回收集管中。（2）加入20μlPCR反应产物，向其中加入20μl溶液PC，混匀。（3）将上一步所得溶液加入CB2吸附柱中（吸附柱放入收集管中），室温静置2min，12000rpm离心1min，倒掉收集管中废液，将吸附柱放回收集管中。向吸附柱CB2中，加入600μl的漂洗液PW，12000rpm离心1min，倒掉收集管中废液，将吸附柱放回收集管中。（4）重复步骤（4）。（5）将吸附柱放回收集管中，12000rpm离心2min，室温下静置数分钟，彻底晾干。（6）将吸附柱CB2放入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50μlddH2O，室温静置2min，12000rpm离心2min，收集离心管内DNA溶液。1.2.6.4目的基因与pCR2.1载体的连接反应根据美国Invitrogen公司的pCR2.1载体试剂说明书操作。将纯化后PCR产物浓度稀释至12.6ng/μl，然后吸取1μl稀释后的PCR产物加入连接反应体系中（见表2.4），置14℃过夜。28 福建医科大学硕士学位论文表2.4连接反应体系（总反应体系10μl）名称体积PCR产物15×Ligntion缓冲液2pCR2.1载体(2.5μg/μl)2T4DNALigase(5U/μl)1ddH2O41.2.6.5将重组质粒导入TOP10感受态细胞（1）取50μlTOP10感受态细胞于冰上融化；（2）吸取2μl上述的重组质粒加入到含有50μl融化的TOP10感受态细胞的EP管中。轻轻旋转离心，于冰浴中静置30min；（3）将上步骤中的EP管置于42℃，水浴60~90s，而后快速转移至冰浴中2~3min，此过程勿动；（4）加入450μl肉汤于上步EP管中，混匀，置37℃摇床中，180rpm/min，50min；（5）混匀上步EP管内液体，吸取100μl管内液体加至含药M-H平板上（含100μg/ml氨苄西林及80μl，20mg/mlX-gal），用无菌弯曲玻璃棒均匀涂开，置37℃，孵育12~16h。1.2.6.6抗性筛选与蓝白筛选因TOP10感受态细胞对氨苄西林敏感，而pCR2.1载体上含有抗氨苄西林的耐药基因，故只有成功导入质粒的TOP10感受态细胞才可在上述的含药平板上生长。根据蓝白筛选原理，转化了空载体，即导入未重组质粒的细菌，菌落颜色为蓝色，导入了重组质粒的细菌，即目的重组菌，菌落颜色为白色。1.2.4.7重组菌的耐药检测1.2.4.7.1筛查NDM-full与Pre-NDM-full基因采用煮沸法提取重组菌的DNA模板，具体步骤同第一部分。扩增产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳，凝胶成像分析系统观察结果，确定条带大小是否与预期结29 福建医科大学硕士学位论文果一致，并将阳性结果送上海博尚生物技术有限公司测序，测序结果通过BLAST与GenBank中的序列进行比对，确定是否为NDM-full（仅含NDM-1、NDM-6及NDM-9全长基因）与Pre-NDM-full（含启动子的NDM-1、NDM-6及NDM-9全长基因）序列。PCR扩增引物序列见表1.1，体系及条件同OXA-51-like基因检测。1.2.4.7.2革兰阴性细菌药敏卡片（AST-GN16）鉴定重组细菌经VITEK-2compact全自动微生物分析仪，进行菌种鉴定和药敏试验。1.2.4.7.3琼脂稀释法测定重组菌对亚胺培南的MIC值制备0.5麦氏浊度单位的待检菌，用生理盐水1∶10稀释。而后用移液枪吸取约2μl的的待检菌接种于含有不同浓度亚胺培南（最高浓度为512μg/ml，倍比稀释至0.125μg/ml，共有13种浓度）的琼脂平板表面，每点菌数大约为104CFU，形成直径约为5~8mm的菌斑，置35℃，16~20h，以抑制细菌生长的最低药物浓度为该菌的MIC。2结果2.1NDM-1型基因阳性不动杆菌的鉴定、药敏与金属酶表型检测经第一部分实验证实，在NDM-1型基因阳性10株不动杆菌中，2株为鲍曼不动杆菌，5株为Pittii不动杆菌，3株为Nosocomialis不动杆菌，采用亚胺培南Etest试纸条进行亚胺培南药敏试验验证，结果均对亚胺培南耐药。10株不动杆菌金属酶表型检测试验结果均为阳性，具体见表2.5和表2.6。2.210株NDM-1型基因阳性不动杆菌A、B和D类碳青霉烯酶基因检测及测序结果在2株携带NDM-1型基因的鲍曼不动杆菌中，1株OXA-23-like基因阳性，其余碳青霉烯酶基因筛查均阴性，另一株除NDM-1型基因阳性外其他检测的碳青霉烯酶基因全阴性。在5株携带NDM-1型基因的Pittii不动杆菌中，2株OXA-58-like基因阳性，其余碳青霉烯酶基因均阴性。在3株携带NDM-1型基因的Nosocomialis不动杆菌中，碳青霉烯酶基因均为阴性。30 福建医科大学硕士学位论文表2.510株NDM-1型基因阳性不动杆菌药敏检测结果抗菌药物鲍曼不动杆菌Pittii不动杆菌Nosocomialis不动(n=2)(n=5)杆菌(n=3)SIRSIRSIR亚胺培南0/20/22/20/50/55/50/30/33/3美罗培南0/20/22/20/50/55/50/30/33/3哌拉西林/他唑巴坦0/20/22/20/54/51/52/31/30/3头孢他啶0/20/22/20/50/55/50/30/33/3头孢吡肟0/20/22/20/50/55/50/30/33/3庆大霉素0/20/22/21/51/53/50/30/33/3妥布霉素2/20/20/24/50/51/53/30/30/3环丙沙星2/20/20/21/51/53/53/30/30/3左氧氟沙星1/21/20/22/52/51/53/30/30/3表2.610株NDM-1型基因阳性不动杆菌的亚胺培南药敏试验（Etest法）与金属酶表型检测结果编号菌种亚胺培南药表型筛查结果敏试验（IP/IPI）C14鲍曼不动杆菌R（>32a）阳性（>32b）C50鲍曼不动杆菌R（>32）阳性（>24）A605Pittii不动杆菌R（>32）阳性（>24）606Pittii不动杆菌R（>32）阳性（>32）609Pittii不动杆菌R（>32）阳性（>16）625Pittii不动杆菌R（>32）阳性（>192）640Pittii不动杆菌R（>32）阳性（>124）A607Nosocomialis不动杆菌R（>32）阳性（32）611Nosocomialis不动杆菌R（>32）阳性（64）615Nosocomialis不动杆菌R（>32）阳性（>192）注：a表示测定的实际MIC值（单位为μg/ml）。b表示IP/IPI实际测定值。31 福建医科大学硕士学位论文2.310株NDM-1型基因阳性不动杆菌OMPs基因检测在2株携带NDM-1型基因的鲍曼不动杆菌中，1株鲍曼不动杆菌的carO和oprD基因均为阳性，1株carO基因为阳性，oprD基因为阴性。在5株携带NDM-1型基因的Pittii不动杆菌中，carO基因均为阴性，oprD基因均为阳性。在3株携带NDM-1型基因Nosocomialis不动杆菌中，carO和oprD基因均为阳性。结果见表2.7。2.410株NDM-1型基因阳性的不动杆菌外排泵基因检测在2株携带NDM-1型基因鲍曼不动杆菌中，adeB、adeI、adeJ、及adeK基因均为阳性。在5株携带NDM-1型基因的Pittii不动杆菌中，adeI、adeK基因均为阳性，4株adeJ基因阳性，1株adeB基因阳性。在3株携带NDM-1型基因的Nosocomialis不动杆菌中，adeB、adeI、adeJ及adeK基因均为阳性。以上菌株均未检测到adeS基因。结果见表2.7。表2.710株NDM-1型基因阳性不动杆菌OMPs与外排泵基因检测结果菌种carOoprDadeBadeIadeJadeKadeS鲍曼不动杆菌2/21/22/22/22/22/20/2（n=2)Pittii不动杆菌0/55/51/55/54/55/50/5（n=5)Nosocomialis不动杆菌3/33/33/33/33/33/30/3（n=3)2.5NDM-1、NDM-6及NDM-9酶水解亚胺培南能力的比较TOP10感受态细胞与重组菌全部经VITEK-2compact全自动微生物分析仪鉴定，均为大肠埃希菌。以TOP10感受态细胞与含有空载体的重组菌为阴性对照，TOP10感受态细胞药敏结果表现为对全有抗生素均敏感，由于空载体上含有相应的药物抗性基因以及不含启动子的NDM型基因无法表达，所以仅含有空载体的重组菌及含有NDM-1-full型基因、NDM-6-full型基因和NDM-9-full型基因的重组菌表现为对氨苄西林与β-内酰氨酶抑制剂的复合制剂耐药外，对其它抗生素如氨曲南、妥布霉素、庆大霉素、环丙沙星、左氧氟沙星、头孢西丁、头孢唑啉、头32 福建医科大学硕士学位论文孢吡肟及亚胺培南均敏感。而含有Pre-NDM-1-full型基因、Pre-NDM-6-full型基因及Pre-NDM-9-full型基因的重组菌对氨苄西林、β-内酰氨酶抑制剂的复合制剂、亚胺培南、头孢西丁、头孢唑啉和头孢吡肟耐药外，对其它类抗生素敏感，其中对亚胺培南的耐药性方面存在差异，携带有Pre-NDM-1-full型基因、Pre-NDM-6-full型基因和Pre-NDM-9-full型基因的重组菌对亚胺培南的MIC值分别为32μg/ml、128μg/ml和64μg/ml。具体药敏结果见表2.8。3讨论本次研究的10株含NDM-1型基因的不动杆菌，药敏结果表现为均对亚胺培南、美罗培南、头孢他啶和头孢吡肟耐药，但对其它抗生素如环丙沙星、妥布霉素和左氧氟沙星等敏感性较高，与部分学者研究发现携带NDM-1型基因的不动杆菌对除氨曲南外对几乎所有的β-内酰胺酶抗生素耐药，但对喹诺酮类抗生素及氨基糖苷类抗生素部分敏感的研究结果相似[90-93]。筛查该10株耐药菌的碳青霉烯酶基因，只有1株鲍曼不动杆菌OXA-23-like基因阳性，2株Pittii不动杆菌的OXA-58-like基因阳性，其余碳青霉烯酶基因阴性。提示本地发现的10株耐药菌的碳青霉烯酶耐药机制主要与NDM-1型基因有关。在不动杆菌对碳青霉烯类抗生素的耐药机制研究中，对于OMPs与外排泵在其中所起作用的研究相对少见。与不动杆菌耐碳青霉烯类抗生素有关的的OMPs主要为CarO蛋白，研究认为鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗生素敏感性下降与CarO蛋白缺失有关[94]，但也有研究认为CarO蛋白是抗生素对鲍曼不动杆菌作用的非特异性通道[17]。OprD蛋白缺失引起菌株对碳青霉烯类抗生素的耐药，在铜绿假单胞菌中比较常见。研究表明外排泵系统（包括AdeABC、AdeFGH、AdeIJK等）也是引起鲍曼不动杆菌多重耐药的重要因素之一[95]。而目前发现与耐碳青霉烯类抗生素有关的外排泵为AdeABC与AdeIJK[96-97]。AdeABC的结构基因片段主要为adeB，其上游含有adeS调节基因，AdeIJK的的结构基因片段主要为adeI、adeJ和adeK[98]。本次实验研究10株不动杆菌，adeS基因均为阴性，而adeS基因可以根据周围环境条件的变化，来调控外排泵基因的表达[99]，因此可认为该10株不动杆菌对碳青霉烯类抗生素耐药可能与AdeABC外排泵无关。33 福建医科大学硕士学位论文2.8携带NDM-1、NDM-6及NDM-9型基因的TOP10重组菌的药敏结果阿莫西林哌拉西林/氨曲南妥布霉素庆大霉素氨苄西林/棒酸他唑巴坦头孢西丁头孢曲松头孢吡肟亚胺培南（μg/ml）（μg/ml）（μg/ml）（μg/ml）（μg/ml）（μg/ml）（μg/ml）（μg/ml）（μg/ml）（μg/ml）菌株MIC结MIC结MIC结MIC结MIC结MIC结MIC结MIC结MIC结MIC结果果果果果果果果果果TOP10≤1S≤1S≤1S8S4S≤4S8S≤1S≤1S0.25STOP10+pCR2.1≤1S≤1S≤1S≥32R≥32R≥128R8S≤1S≤1S0.25STOP10+pCR2.1+≤1S≤1S≤1S≥32R≥32R≥128R8S≤1S≤1S0.25SNDM-1TOP10+pCR2.1+≤1S≤1S≤1S≥32R≥32R≥128R8S≤1S≤1S0.25SNDM-6TOP10+pCR2.1+≤1S≤1S≤1S≥32R≥32R≥128R8S≤1S≤1S0.25SNDM-9TOP10+pCR2.1≤1S≤1S≤1S≥32R≥32R≥128R≥64R≥64R≥64R32R+Pre-NDM-1TOP10+pCR2.1≤1S≤1S≤1S≥32R≥32R≥128R≥64R≥64R≥64R128R+Pre-NDM-6TOP10+pCR2.1≤1S≤1S≤1S≥32R≥32R≥128R≥64R≥64R≥64R64R+Pre-NDM-9注：亚胺培南的MIC值采用琼脂稀释法测定；其余药敏结果来自VITEK-2compact全自动微生物分析仪测定结果34 福建医科大学硕士学位论文5株Pittii不动杆菌的carO基因均为阴性，OprD基因与AdeIJK外排泵基因大多为阳性，推测该5株Pittii不动杆菌对碳青霉烯类抗生素耐药主要可能是由CarO缺失，AdeIJK外排泵的表达及NDM-1型基因共同作用的结果。而Nosocomialis不动杆菌与鲍曼不动杆菌OMPs基因大部分阳性，推测这两类细菌对碳青霉烯类抗生素耐药可能主要与AdeIJK外排泵的表达和NDM-1型基因表达有关。有关外排泵系统表达及OMPs的缺失导致不动杆菌对碳青霉烯类抗生素的耐药机制还有待于进一步研究。MBL可水解头孢菌素类、青霉素类及碳青霉烯类抗生素，且不被β-内酰胺酶抑制剂所抑制。自2009年，首次报道产NDM-1型基因的菌株以来，产NDM-1型基因的菌株迅速在世界各地播散开来。而NDM-6型基因在2012年第一次报道以来，近3年来鲜有关于NDM-6型基因的报道，国内也尚未有发现携带有NDM-6型基因的细菌。NDM-9型基因，首次报道是在2014年5月，由我国学者在肺炎克雷伯菌发现[100]。目前文献中未有对NDM-1、NDM-6和NDM-9型基因同时进行耐药性研究的报道。本次研究，通过转化实验，将不含启动子的NDM-1、NDM-6、NDM-9型基因成功转化入TOP10感受态细胞后，因基因上游缺乏启动子序列，导致这3种基因不转录和翻译出相应的蛋白质，使得它们的药敏结果与转化了空载体的重组菌的药敏结果相似，仅对氨苄西林与β-内酰胺酶抑制剂复合制剂耐药。而携带有启动子基因序列的NDM-1、NDM-6及NDM-9型基因的重组菌，在上游启动子的作用下，能够转录和翻译出相应的碳青霉烯酶，水解抗生素，故表现出为对碳青霉烯类、头霉菌素类、拉氧头孢类抗生素及β-内酰胺酶抑制剂的复合制剂耐药，但仍对氨基糖苷类、喹诺酮类抗生素敏感。对于NDM型基因，目前已发现了15个型别，而它们之间大多只有几个碱基的差别。NDM-6型基因、NDM-9型基因与NDM-1型基因的区别是分别在基因698位置(C→T)和454位置(G→A)上存在有一个碱基的改变，从而导致氨基酸分别由丙氨酸转变为缬氨酸和谷氨酸转变为赖氨酸。通过本研究发现含Pre-NDM-6型基因的重组菌对亚胺培南的耐药性最强，而含Pre-NDM-1型基因重组菌对亚胺培南的耐药性较弱，与国外学者研究发现的携带NDM-1型基因的细菌对碳青霉烯类抗生素的耐药性不及携带其它型基因的细菌的结果类似[101-103]。虽然丙氨酸和缬氨酸都属于非极性氨基酸，但氨基酸的改变可能导致蛋35 福建医科大学硕士学位论文白质构象的改变；谷氨酸是极性带负电荷的氨基酸而赖氨酸是极性带正电荷的氨基酸，此氨基酸的改变不仅使得蛋白质组成成分发生变化，电荷分布的变化也可能导致蛋白质构象发生变化，从而可能导致对碳青霉烯酶类抗生素水解活性的不同，具体机制有待于进一步研究。随着抗生素的广泛使用，耐碳青霉烯类不动杆菌的将会逐渐增多，其耐药机制也越来越复杂，而如今的研究成果还不能全面揭示不动杆菌对碳青霉烯类抗生素的耐药机制，更深入的耐药机制还有待进一步研究。36 福建医科大学硕士学位论文第三部分福州市耐碳青霉烯类不动杆菌分子流行病学研究1材料和方法1.1材料1.1.1菌株来源挑选2010年9月~2014年8月临床分离的58株非重复的耐碳青霉烯类Acb复合体，其中50株为CRAB，39株来自福建医科大学附属协和医院，9株来自福建医科大学附属第一医院，2株来自南京军区福州总医院。5株Pittii不动杆菌和3株Nosocomialis不动杆菌，该8株耐药菌均来自福建医科大学附属协和医院。1.1.2主要试剂（1）超纯微生物DNA提取试剂盒：美国MOBIO司；（2）不动杆菌属REP-PCR分型试剂盒：法国生物梅里埃公司；（3）DiversiLab芯片：美国Agilent公司；（4）TaqDNA聚合酶(2.5U/μl)、dNTP(2.5mmol/L)：北京天根生化科技有限公司。1.1.3M-H培养基配制见本研究第一部分。1.1.4主要仪器（1）LRH-250F生化培养箱：上海一恒科技有限公司；（2）BSC-1360ⅡB2生物安全柜：北京东联哈尔仪器厂；（3）VITEK-2compact全自动微生物分析仪：法国生物梅里埃公司；（4）DK-420S型三用恒温水箱：上海精宏实验设备有限公司；（5）V-32漩涡混合器：上海医大仪器厂；（6）5424R型台式高速冷冻离心机：德国Eppendorf公司；（7）ND-1000微量紫外可见分光光度计：美国NanoDrop公司；（8）Veriti96孔梯度PCR扩增仪：美国AppliedBiosystems公司；（9）Agilent2100生物分析仪：美国Agilent公司。37 福建医科大学硕士学位论文1.2方法1.2.1菌株鉴定具体见本研究第一部分。1.2.2细菌基因组DNA的提取依照超纯微生物DNA提取试剂盒操作说明书提取细菌基因组DNA，具体步骤如下：（1）用1μl一次性接种环挑取2环M-H平板上过夜纯培养的菌落，加入到含有300μlMicroBead液体的MicroBead试管中。（2）50μlMD加入到上述MicroBead试管中，95℃水浴5min。（3）高速振荡MicroBead试管，而后离心30s，10000g。（4）100μl的MD2液体加入到另一洁净的2ml离心管中，吸取步骤（3）中的上清，至少200μl，加入到MD2液体中，轻轻振荡，而后放于4℃，至少2h。（5）450μl的MD3液体加入到另一洁净的2ml离心管中，离心步骤（4）中试管1min，10000g，将200μl上清加入到含MD3液体离心管中。轻轻振荡，低速瞬时离心。（6）将步骤(5)中上清加入到洁净过滤膜中，离心30s，10000g，弃过滤液，过滤膜放回新的离心管。（7）300μlMD4加入上述过滤膜中，离心30s，10000g，弃过滤液，过滤膜放回新的离心管。（8）离心60s，10000g，过滤膜放入一洁净的2ml离心管中，在过滤膜中心位置，加入35μlMD5。（9）常温孵育2分钟，离心30s，10000g，弃过滤膜，保存离心管的DNA。（10）分光光度计测DNA浓度，调整浓度在25~50ng/μl之间。1.2.3REP-PCR扩增根据不动杆菌属REP-PCR分型试剂盒的要求，应用REP-PCR引物进行扩增，配制25μlPCR反应体系，具体参数如下表3.1。REP-PCR反应参数为：94℃预变性2min；94℃变性30s，50℃退火30s，70℃延伸90s，循环35次；70℃延伸3min。38 福建医科大学硕士学位论文表3.1REP-PCR反应体系（总反应体系25μl）名称体积基因组DNA2PrimerMixA2PCRMM11810×Taq缓冲液2.50.5μlTaq聚合酶(2.5U/μl)0.51.2.4REP-PCR扩增产物检测1.2.4.1制备胶-染料混合液：（1）将DiversiLabDNA芯片试剂盒内试剂于室温放置30min。（2）吸出200μlDNAGelMatrix和10μlDNADyeConcentrate于1.5ml净离心管中，短暂震荡离心管，使溶液混匀。（3）将混匀后的溶液加入到试剂盒中离心滤器中，室温1500g离心10min，丢掉过滤膜，滤器中即为胶-染料混合液（Gel-dyemix），放于4℃避光保存。1.2.4.2制胶及加样（1）取出一块DiversiLabDNA芯片，空白处写上芯片号，吸取9μlGel-dyemix加入芯片上的G孔中。（2）将芯片立即放置灌胶工作台上进行灌胶。（3）灌胶完毕后，加入9μlGel-dyemix于芯片上的2个废弃孔中。（4）在所有孔中加入5μl混匀的DNAMarker。（5）在Ladder孔内加1μlLadder，1~12孔内加入1μlREP-PCR产物。（6）将上述芯片放入漩涡振荡适配器中，2200g，离心1min。（7）上述芯片在5分钟内放入Agilent2100生物分析仪进行分析。1.2.5结果检测和分析运用Agilent2100生物分析仪进行结果检测，并使用DiversiLab分型系统配套软件分析，可得到各菌株相应的树状图与虚拟电泳图。根据虚拟电泳图中条带的位置、数目等特征及树状图相似性判断菌株的同源性。同源性判断标准：无差39 福建医科大学硕士学位论文别：树状图相似度大于97.5％，且虚拟电泳图没有条带差异；相似：树状图相似性大于95％，虚拟电泳图上有1~2个不同的条带或条带的位置不同；不同：树状图相似性小于95％，虚拟电泳图上有≥3的条带不同或条带的位置不同[104]。2结果2.1菌株鉴定与药敏结果经第一部分实验证实，在58株菌株中，50株为鲍曼不动杆菌，5株为Pitti不动杆菌，3株为Nosocomialis不动杆菌，均对亚胺培南耐药。2.2基因分型结果2.2.1CRAB的分型结果CRAB共50株，其中福建医科大学附属协和医院39株，2株携带NDM-1基因（编号C14与C50号），9株来自福建医科大学附属第一医院（编号为S1、S2、S5、S6、S7、S8、S9、S10、S12），2株来自南京军区福州总医院（编号为Y1和Y3）。50株CRAB可分为A、B、C、D、E、F和G，共七个型别。其中，除了C型与D型CRAB外，其余型别CRAB均来自福建医科大学附属协和医院，结果见图3.1。A型CRAB和B型CRAB各1株，分别来自福建医科大学附属协和医院神经内科与综合ICU，2株均携带NDM-1型基因。C型CRAB4株，其中3株来自福建医科大学附属协和医院综合ICU（2株）和烧伤ICU（1株），另1株来自南京军区福州总医院普通外科。D型CRAB7株，全部来自福建医科大学附属协和医院烧伤ICU。E型CRAB1株，来自福建医科大学附属协和医院综合ICU。F型CRAB共35株，25株来自福建医科大学附属协和医院，在该25株CRAB中，有18株来自综合ICU，3株来自烧伤ICU，各有一株来自骨科、普通外科、神经内科与呼吸内科；9株来自福建医科大学附属第一医院，在该9株CRAB中，5株来自ICU，2株神经外科，1株来自口腔外科，另1株来自急诊科；还有1株来自南京军区福州总医院肝胆外科。G型CRAB1株，来自福建医科大学附属协和医院血液科一区，结果见图3.1。2.2.1Pittii不动杆菌和Nosocomialis不动杆菌的分型结果40 福建医科大学硕士学位论文5株Pittii不动杆菌可分为A和B两型，菌株均来自来自福建医科大学附属协和医院。其中A型2株，1株来源于血液科二区，另1株来自呼吸内科。B型3株，1株来自血液科二区、2株来自综合ICU，结果见图3.2。3株Nosocomialis不动杆菌可分为A和B两型，菌株均来自来自福建医科大学附属协和医院。其中A型2株，B型1株，均来自血液科二区，结果见图3.3。2.358株耐碳青霉烯类不动杆菌间同源性分析50株CRAB菌株间的同源性用不同颜色来表示，深红色表示范围为95％~100％，表示菌株之间同源性相似，浅红色表示范围为90％~95％，在该范围以下均表示菌株间的同源性无关系，蓝色表示范围为80％~90％，黄色表示范围为70％~80％，灰色表示范围为≤70％，结果见图3.4。从图3.4中可看出各型的CRAB在不同菌株间的同源性较差。除C型和D型CRAB间的同源性较好外，其余型别的CRAB同源性均相差较大。5株Pittii不动杆菌和3株Nosocomialis不动杆菌均分为A和B两型，它们各自的A和B型间的耐药菌的同源性相差均较大，见图3.5和3.6。3讨论不动杆菌属细菌大多属于条件致病菌，其可以引起呼吸道感染、尿路感染，甚至引起败血症和脑膜炎等疾病，严重威胁患者的生命。由于抗生素的滥用加快了细菌的耐药速度，出现了耐碳青霉烯类不动杆菌，使得临床治疗和预防工作面临极大挑战。因此，为了控制耐碳青霉烯类不动杆菌的传播，及早和准确地发现耐药菌株来源并且分析其流行型别就显得十分重要。目前用于鲍曼不动杆菌基因分型的方法很多，主要包括随机扩增多态性DNA（RandomamplifedpolymorphicDNA，RAPD）、扩增片段长度多态性（Amplifiedfragmentlengthpolymorphism，AFLP）、多位点序列分型（Multilocussequencetyping，MLST）、REP-PCR、低频限制性位点区聚合酶链式反应(Infrequent-restriction-sitePCR，IRS-PCR)和PFGE等方法[105]。PFGE是公认的微生物分子分型方法的金标准[106]，但是PFGE操作复杂，费用高，所需时间长，不适于大量样本分析，不能实时评估疫情和提供全面的监控和流行病学数据[107]，而且因为PFGE分辨率过高，可能会将原本相关的菌株判定为流行病学无41 福建医科大学硕士学位论文关菌株[108]。RAPD虽然灵敏度高，操作简便，但其重复性差[107]，而MLST、AFLP图3.150株CRAB基因分型结果注：编号为S1、S2、S5、S6、S7、S8、S9、S10、S12菌株，来自福建医科大学附属第一医院；编号为Y1和Y3菌株来自南京军区福州总医院；其余菌株均来自福建医科大学附属协和医院。42 福建医科大学硕士学位论文图3.25株Pittii不动杆菌的分型结果图3.33株Nosocomialis不动杆菌的分型结果43 福建医科大学硕士学位论文图3.450株CRAB间同源性比较图图3.55株Pittii不动杆菌间同源性比较图图3.63株Nosocomialis不动杆菌间同源性比较图44 福建医科大学硕士学位论文和IRS-PCR三种方法虽均具有较高的分辨力和重复性，但都存在一些缺点，如检测费用昂贵、操作费时和费力等[105,109]。本实验采用基于REP-PCR的DiversiLab分型系统，虽存在费用较高和不同菌种需采用不同的试剂盒等缺点[110]，但具有操作简单，重复性好，检测快速和实时检测等优点，而且其分型结果与PFGE一致性好[28,111]，是较为理想的细菌分型方法。本研究利用DiversiLab分型系统对福州市临床分离的50株CRAB进行分型，共分为七个型别，说明这些菌株来源不同。F型CRAB有35株，25株来自福建医科大学附属协和医院，该25株中有15株来自综合ICU，说明F型CRAB是福建医科大学附属协和医院综合ICU的最主要流行株。有1株来自南京军区福州总医院。9株来自福建医科大学附属第一医院，该9株来源于医院的ICU、神经外科、口腔外科和急诊科等不同科室，提示F型CRAB是福建医科大学附属第一医院最主要的流行株，同时也提示可能存在院间传播耐药菌的可能。F型CRAB有35株，占全部CRAB分型总数的70%，提示F型CRAB有可能是福州市最主要流行株，该流行株与国内外部分地区报道的主要流行株是一致的[112-116]，但也有与部分地区报道不同[117-120]，可知在不同地域，CRAB的分子流行情况存在差别。因此，在福州市建立CRAB的数据库和监测平台，掌握CRAB在福州市的流行病学，可为预防CRAB的流行和及早采取有效措施提供坚实的基础。D型CRAB共有7株，且均来自福建医科大学附属协和医院烧伤ICU，说明D型CRAB是烧伤ICU最主要的流行株，与综合ICU主要流行的型别不同。以上结果说明，及时鉴定出耐药菌株型别对及时找到传播源头及采取措施有重要意义。C型、E型和G型CRAB数量较少，且来自不同医院，不同科室，考虑为散发性传播。2株携带NDM-1型基因的CRAB，分为A和B两型，与国外学者对携带NDM-1型基因鲍曼不动杆菌的分型结果不一致[121]，也与过国内外学者报道的CRAB分型结果不符[28,120]，提示该2株CRAB与其他CRAB型别不同。本次研究对5株Pittii不动杆菌和3株Nosocomialis不动杆菌分型，均分为A和B两型，与国外的分型结果不同[104]。目前国内外关于利用DiversiLab分型系统对该2种菌株分型的报道还比较少见，有待于我们对其进一步研究探讨。45 福建医科大学硕士学位论文结论1.福州市临床分离的CRAB耐碳青霉烯类的机制主要与产OXA-23-like碳青霉烯酶相关。2.第一次在耐碳青霉烯类Pittii不动杆菌中同时检出NDM-1型基因与OXA-58-like型基因。3.第一次在福建省内发现携带OXA-24-like、OXA-58-like和NDM-1型基因的CRAB。4.NDM-1型基因阳性的Pittii不动杆菌对碳青霉烯类抗生素耐药主要可能是外膜孔蛋白CarO缺失，AdeIJK外排泵及NDM-1酶共同作用的结果。而NDM-1型基因阳性的Nosocomialis不动杆菌与鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗生素耐药可能主要与AdeIJK外排泵及和NDM-1酶有关。5.NDM-1、NDM-6及NDM-9酶水解亚胺培南能力从强到弱依次为NDM-6、NDM-9和NDM-1酶。6.福州市流行的CRAB基因型为F型。在福建医科大学附属协和医院烧伤ICU和综合ICU流行的CRAB基因型不同，前者为D型，后者为F型。46 福建医科大学硕士学位论文参考文献[1]KimDH,ParkYK,ChoiJY,etal.IdentificationofgeneticrecombinationbetweenAcinetobacterspeciesbasedonmultilocussequenceanalysis.DiagnMicrobiolInfectDis.2012,73(3):284-286.[2]Gerner-SmidtP,TjernbergI,UrsingJ.ReliabilityofphenotypictestsforIdentificationofAcinetobacterspecies.JClinMicrobiol.1991,29(2):277-282.[3]MaslunkaC,GiffordB,TucciJ,etal.Insertionsordeletions(Indels)intherrn16S-23SrRNAgeneinternaltranscribedspacerregion(ITS)compromisethetypingandidentificationofstrainswithintheAcinetobactercalcoaceticus-baumannii(Acb)complexandcloselyrelatedmembers.PLoSOne.2014,9(8):e105390.[4]McConnellMJ,ActisL,PachónJ.Acinetobacterbaumannii:humaninfections,Factorscontributingtopathogenesisandanimalmodels.FEMSMicrobiolRev.2013,37(2):130-155.[5]DijkshoornL,NemecA,SeifertH.Anincreasingthreatinhospitals:mμltidrug-resistantAcinetobacterbaumannii.NatRevMicrobiol.2007,5(12):939-951.[6]PoirelL,NordmannP.CarbapenemresistanceinAcinetobacterbaumannii:mechanismsandepidemiology.ClinMicrobiolInfect.2006,12(9):826-836.[7]陈佰义,何礼贤.胡必杰,等.中国鲍曼不动杆菌感染诊治与防控专家共识.中华医学杂志.2012,92(2):76-85.[8]陈海红,李华茵,何礼贤.耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌的耐药机制研究进展.中国呼吸与危重监护杂志.2010,9(4):439-443.[9]童卫杭,王睿.不动杆菌属细菌对碳青霉烯类抗生素耐药机制及用药选择.中华医学杂志.2006,86(35):2516-2519.[10]ZarrilliR,PournarasS,GiannouliM,etal.Globalevolutionofmultidrug-resistantAcinetobacterbaumanniiclonallineages.IntJAntimicrobAgents.2013,41(1):11-19.[11]FuY,DuX,JiJ,etal.EpidemiologicalcharacteristicsandgeneticstructureofblaNDM-1innon-baumanniiAcinetobacterspp.inChina.AntimicrobChemother.2012,67(9):2114-2122.[12]ChenZ,QluS,WangY,etal.CoexistenceofblaNDM-1withtheprevalent47 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福建医科大学硕士学位论文综述耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌耐药机制研究进展【摘要】鲍曼不动杆菌是一种常见的条件致病菌，容易通过交叉感染在医院内、医院间传播。近些年来，鲍曼不动杆菌引起的医院感染有逐年增加的趋势，且其耐药情况日益严重，尤其是耐碳青霉烯类的鲍曼不动杆菌逐渐增多，此类感染严重威胁患者的生命。因此，了解它的流行病学和其耐药机制就显得非常重要。本文将对鲍曼不动杆菌的流行病学，以及耐药机制进行阐述。鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类药物的耐药主要与碳青霉烯酶的产生、外膜孔蛋白的表达缺失或下调、药物的主动外排泵系统活性增强和青霉素结合蛋白的改变有关。【关键词】流行病学，碳青霉烯类，鲍曼不动杆菌，耐药鲍曼不动杆菌(Acinetobacterbaumannii，AB)是一种重要的革兰阴性条件致病菌，存在于正常人体的皮肤、结膜、口腔、呼吸道、胃肠道及泌尿生殖道等部位，因其有较强的抵抗力，在医院环境中可长期存在，是引起医院感染的常见病原菌之一，当人体免疫力低下时，可引起各种的继发感染。世界各地已陆续出现鲍曼不动杆菌爆发流行的报道[1]。碳青霉烯类抗生素是治疗鲍曼不动杆菌感染的首选药物。耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌(Carbapenem-resistantAcinetobacterBaumannii，CRAB)的出现给临床治疗带来了极大的麻烦，由此引发的感染往往是无药可救，病死率极高。因此CRAB的耐药机制研究已成为普遍关注的焦点。1CRAB的流行病学和耐药趋势根据美国院内感染监测数据及中国院内感染病原菌调查显示，鲍曼不动杆菌是医院感染重要的条件致病菌，特别是在免疫力低下的患者中，可以引起严重败血症、肺炎甚至死亡[2]。近年来，由于大量使用和滥用抗菌药物，使得鲍曼不动杆菌的耐药性特别是对碳青霉烯类抗生素的耐药性呈现逐渐上升的趋势。而且鲍曼不动杆菌可以在干燥物体表面存活长达25天以上，非常容易造成流行，给临床的治疗带来极大的困难，也对院内感染的控制提出了新的要求。自1991年美国首例的CRAB报道以来，世界各地都有对CRAB的报道，遍及欧洲、大洋洲、南北美洲、亚洲和非洲等地[3-4]。临床上的菌株大多分离自ICU59 福建医科大学硕士学位论文病房，且以痰标本为主，其对碳青霉烯类抗生素的耐药性，呈现逐年上升的趋势。2001年，我国14所医院的耐药监测数据表明，鲍曼不动杆菌对亚胺培南的耐药率还小于5％[5]。然而到2005年，我国CHINET细菌耐药性监测显示，鲍曼不动杆菌对亚胺培南的耐药增加到31%[6]，而且在2008年-2012年期间对亚胺培南的耐药率呈逐年上升的趋势[7-11]。2CRAB耐药机制CRAB的耐药机制相对复杂，主要包括：产碳青霉烯酶、外膜孔蛋白(Outermembraneproteins，OMPs)的表达缺失或下调、药物的主动外排泵系统活性增强和青霉素结合蛋白(Penicillin-bindingproteins，PBPs)的改变等[12]。而耐药性的产生通常是其中一种或者几种机制共同作用的结果。而这些耐药机制中，产碳青霉烯酶是最主要的耐药机制。2.1碳青霉烯酶的产生碳青霉烯酶是指所有能水解碳青霉烯类的β-内酰内酰胺酶。依据Ambler分子分类将碳青霉烯酶分为三类：①A类酶，为丝氨酸蛋白酶，利用活性位点丝氨酸残基灭活β-内酰胺类药物，可被克拉维酸和他唑巴坦抑制，对亚胺培南的水解活性强于美罗培南；②B类酶，为金属β-内酰胺酶（Metallo-β-lactamase，MBL），简称金属酶可被金属螯合剂依地酸和巯基类化合物所抑制，不能被克拉维酸、舒巴坦抑制，多数B类金属酶对亚胺培南的水解活性大于美罗培南；③D类酶，为苯唑西林酶（Oxacillinase，OXA），简称OXA型酶，可被舒巴坦抑制。在鲍曼不动杆菌中，水解碳青霉烯类抗生素的酶主要是B类酶和D类酶[12]，A类酶少见。2.1.1OXA型酶目前，水解碳青霉烯类抗生素的D类酶按同源性可分为12组，在鲍曼不动杆菌中发现了6个组，第一组以OXA-23酶为代表，包括OXA-23酶、OXA-27酶和OXA-49酶等，这些酶的基因之间有2~5个氨基酸的差异，其氨基酸同源性达到99％，可水解亚胺培南。OXA-23组酶，是CRAB中除OXA-51组酶外最常见的基因型[13]，也是造成世界多地出现CRAB的主要原因[14-16]，尤其是在英国、巴西、法国、伊拉克、希腊、新加坡和意大利等国家。第二组以OXA-24酶为代表，包括OXA-24/40酶、OXA-25酶、OXA-26酶、和OXA-72酶等，它60 福建医科大学硕士学位论文们的酶基因之间有l~5个氨基酸差异，98％的同源性。OXA-24组酶具有水解亚胺培南、美罗培南等药物的活性，而缺乏水解苯唑西林、氯唑西林、甲氧西林等药物的活性。OXA-24酶是在1997年，由西班牙的学者从鲍曼不动杆菌首次发现并报道，后来证明与OXA-40酶相同。第三组以OXA-51酶为代表，包括OXA-51酶、OXA-64酶、OXA-71酶、OXA-75酶~OXA-80酶等，它们的酶基因之间有l~15个氨基酸差异，多数学者认为OXA-51组酶是天然存在于鲍曼不动杆菌，由染色体介导，有较弱的水解活性，而它的表达不会影响鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗生素的敏感性[3]。第四组以OXA-58酶为代表，包括OXA-58酶、OXA-96酶和OXA-97酶、OXA-164酶，它们的酶基因之间有1~3个氨基酸差异，OXA-58组酶可水解苯唑西林、青霉素、亚胺培南。OXA-58组酶常由质粒介导，已报道引起世界上许多医院的爆发流行，并已发现其经常导致鲍曼不动杆对碳青霉烯类耐药。另外两组分别以OXA-143酶和OXA-48酶为代表。OXA-143组酶基因与OXA-24组酶基因同源性最高，为88％，与OXA-58组酶基因和OXA-23组酶基因同源性分别为52％和63％，研究表明OXA-143酶基因可能是通过同源性重组过程而获得[17]。而OXA-48组酶基因最近才在鲍曼不动杆菌中发现[18]，OXA-143组酶和OXA-48组酶对碳青霉烯类抗生素的水解活性较弱[19]。2.1.2MBLMBL对碳青霉烯类抗生素的水解活性是OXA型酶的100到1000倍[20]。MBL基因可为染色体或质粒所携带，通过质粒或转座子等传播，MBL可水解头孢菌素、青霉素类及碳青霉烯类抗生素，且不被β-内酰胺酶抑制剂所抑制。MBL包括IMP、VIM、GIM、SPM、SIM、NDM、Bc11、Cpha、FEZ等酶，目前鲍曼不动杆菌中经鉴别出来的MBL有IMP、VIM、SMI-1和NDM型。IMP酶现已发现到IMP-48型，其中在鲍曼不动杆菌中发现的有IMP-1、2、4、5、6、8、11、19型[20]。1991年，在日本的铜绿假单菌中首次发现并报道了IMP-1[21]，而后1999年在意大利发现了产IMP-2的鲍曼不动杆菌，与IMP-1的同源性为85.9％。现在IMP家族已在世界各地发现，主要流行在远东地区[22]，其中IMP-4是在中国香港的鲍曼不动杆菌中首次发现并报道[23]。在2002年，IMP-5第一次报道出现在鲍曼不动杆菌中，其酶基因与IMP-1酶基因的同源性为93％。IMP-6、IMP-11与IMP-19第一次报道出现在鲍曼不动杆菌中分别是在2001年、2007年和201161 福建医科大学硕士学位论文年，菌株均分离自日本。2007年，中国大陆首次在鲍曼不动杆菌中检出并报道IMP-8[24]。目前，在鲍曼不动杆菌中检测出的VIM主要有VIM-1、VIM-2、VIM-3、VIM-4、VIM-11型[20]。VIM-1于1997年在意大利的铜绿假单胞菌中发现[25]。在2002年的朝鲜，第一次在鲍曼不动杆菌中发现并报道VIM-2[26]。2008年，首次在鲍曼不动杆菌中检出VIM-3、VIM-11，菌株均分离自中国台湾。在2008年希腊，VIM-4首次在鲍曼不动杆菌中被发现并报道。2005年，韩国学者在CRAB中发现了SMI-1[27]，其属于一种新型的MBL，与IMP有64%到69%的同源性，国内于2011年发现SIM-1，是第二个发现SIM-1的国家[28]，且到目前为止，只发现SIM-1这一型。NDM-1是从瑞典病人的致病菌肺炎克雷伯菌中首次发现并报道[29]。后来的研究发现NDM不仅存在患者标本中，也存在饮用水和渗水样本中[30]，NDM型基因能在大肠埃希菌和鲍曼不动杆菌中能够快速的传播，如今已在加拿大、德国、中国、日本、西班牙、英国、美国、瑞士、澳大利亚等国家均有发现NDM型酶的报道[29,31-32]。到目前为止，已发现到NDM-15型酶，它们的酶基因之间只有1-2个碱基的差别，其中在鲍曼不动杆菌中发现的NDM酶有NDM-1和NDM-2型。2.2OMPs的表达下调或缺失OMPs存在于细菌的外膜上，它可以通过结构变化和调控其基因的表达来逃避抗生素的作用，致使抗生素治疗的无效，这样OMPs在细菌耐药机制方面就发挥了重大的作用。鲍曼不动杆菌也是具有脂质双层的外膜，其OMPs以双分子层形式存在。对于经OMPs作用的碳青霉烯类抗生素来说，因OMPs表达缺失或者下调，阻碍抗生素进入细菌体内，从而导致鲍曼不动杆菌产生耐药性。对CRAB耐药研究较多的OMPs主要是CarO蛋白与OprD蛋白。前者是Limansky等学者在2002年的1株CRAB中发现，并通过实验证明缺失的OMPs与亚胺培南耐药存在相关性，并将其命名为CarO蛋白[33]。后来学者在CarO蛋白形成的离子通道中，并没有发现亚胺培南的特异性结合位点，从而认为CarO蛋白并不是鲍曼不动杆菌特异性的离子通道，而可能是非特异性通道[34]。最初的OprD蛋白是在铜绿假单胞菌中发现的，是一种OMPs通道，Dupont等学者人通过对不同CRAB的OMPs进行分析，发现有OMPs的缺失，进一步研究发现，缺失的OMPs与铜绿假单胞菌的OprD蛋白有明显的同源性，所以认为OprD蛋62 福建医科大学硕士学位论文白可能是碳青霉烯类药物作用的特异性通道[35]。而Catel-Ferreira等学者对鲍曼不动杆菌中OprD蛋白的同源物进行序列分析发现其与碳青霉烯耐药机制无相关性，只是提高了细菌对β-内酰胺类抗生素的适应性[36]。Smani等学者的研究表明仅仅是OprD的缺失，不足够导致鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗生素最小抑菌浓度(Minimalinhibitoryconcentration，MIC）的增加[37]，因此关于鲍曼不动杆菌中OMPs的作用和机制仍待进一步研究。2.3药物的主动外排泵系统活性增强主动外排泵系统是某些细菌天然耐药或获得性多重耐药的重要原因，是细菌产生耐药性的重要原因。药物外排泵系统一般由染色体基因编码，普遍存在于多数细菌中，它们不但参与排出自身的代谢产物，而且还可以排除抗生素等物质[38]。目前药物外排泵可分为5个主要超家族：包括：主要易化子超家族(Majorfacilitatorsuperfamily，MFS)、耐药结节分化超家族(Resistance-nodulation-divisionsuperfamily，RND)、药物代谢物转运体家族(drug/metabolitetransporters，DMT)[包括小多耐药蛋白家族(Smallmultidrugresistantprotein，SMR)]、多药及毒物外排家族(Muhidrugandtoxiccompoundextrusionfamily，MATE)和ATP结合盒超家族(ATP-bindingcassette，ABC)[39]。目前已发现的由鲍曼不动杆菌染色体编码的外排泵系统包括：RND家族的外排泵AdeABC、AdeIJK与AdeFGH；DMT家族的外排泵AheM；MFS家族的外排泵CraA和AmvA；SMR家族的外排泵AbeS。有研究表明，鲍曼不动杆菌对抗生素的耐药性与其外排泵系统有关[40]。而迄今发现的与碳青霉烯类耐药相关的外排泵系统主要是RND家族的AdeABC与AdeIJK[41-42]，前者是在鲍曼不动杆菌中发现的第一个RND家族的外排泵[43]。Hou等学者研究证实AdeABC外排泵过度表达可以导致鲍曼不动杆菌对氨基糖苷类、喹诺酮类、四环素、氯霉素及β-内酰胺类抗生素耐药，同时也可导致对碳青霉烯类抗生素的耐药[44]。2.4PBPs改变碳青霉烯类抗生素是通过不可逆地灭活细菌的肽聚糖转肽酶来发挥抗菌作用，而肽聚糖转肽酶属于PBPs成员，当PBPs结构或数量发生改变时，药物不能与之结合或着药物与之亲和力下降，细菌便出现耐药现象[12]。以PBPs的改变作为CRAB的耐药机制在国内外被研究的比较少。目前已有研究表明，PBPs介63 福建医科大学硕士学位论文导的鲍曼不动杆菌耐药机制主要是PBPs基因由于突变产生与β-内酰胺类亲和力低的新的PBPs，其次是原有PBPs表达量下降[45]。研究表明在亚胺培南MIC＞4mg/L的菌株中，PBPs的缺乏与产生的耐碳青霉烯类有关[46]。Fernandez-Cuenca等学者也在CRAB中发现存在PBPs的缺失[47]。而现在研究表明仅仅是PBPs的改变，还不足以直接导致鲍曼不动杆菌对抗生素的耐药，更有可能是PBPs连同其它耐药机制共同作用导致鲍曼不动杆菌耐药株的产生[48]。3小结CRAB的逐渐增多，引起全世界的广泛关注，国内外学者纷纷对本地区的CRAB进行耐药性的研究，发现CRAB耐药性的产生有些是由于单独产生OXA型酶，还有些是因OMPs丢失、PBPs改变或药物主动外排泵系统的过度表达中的两种或着两种以上共同起作用。其耐药机制较为复杂，现如今的研究成果还不能全面揭示鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗生素的耐药机制。更深入的耐药机制有待于进一步研究，以便对耐药菌株做出快速诊断，从而为指导临床医生合理使用抗菌药物和控制CRAB流行传播提供帮助。64 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福建医科大学硕士学位论文[43]林丽,周歧新,凌保动.鲍曼不动杆菌主动外排系统AdeABC、AdeIJK与多重耐药相关性.中国抗生素杂志.2009,34(2):100-103.[44]HouPF,ChenXY,YanGF,eta1.StudyofthecorrelationofimipenemresistancewitheffluxpumpsAdeABC,AdeLIK,AdeDEandAbeMinclinicalisolatesofacinetobacterbaumannii.Chemoherapy.2012,58(2):152-158.[45]VashistJ,TiwariV,DasR,KapilA,etal.Analysisofpenicilin-bindingprotein(PBPs)incarbapenemresisitantAcinetobacterbaumannii.IndianJMedRes.2011,133(3):332-338.[46]赵颖莹,崔金环.鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗生素的耐药性及其基因的分析.微生物学免疫学进展.2012,40(3):26-29.[47]Fernandez-CuencaF,Martinez-MartinezL,ConejoMC,eta1.Relationshipbetweenbeta-lactamaseproduction.Outermembraneproteinandpenicillin-bindingproteinprofilesontheactivityofcarbapenemsagainstclinicalisolatesofAcinetobacterbaumannii.JAntimicrobChemother.2003,(51):565-574.[48]CayôR,RodríguezMC,EspinalPa,etal.Analysisofgenesencodingpenicillin-bindingproteinsinclinicalisolatesofAcinetobacterbaumannii.AntimicrobAgentsChemother.2011,55(12):5907-5913.69 福建医科大学硕士学位论文致谢硕士求学生活，是我人生中一段重要而又难忘的历程，尽管艰苦但很充实，虽有困难却仍感快乐，因为在我的背后有许多支持和帮助我的人。在此论文完成之际，衷心感谢提携我、帮助我、陪伴我的师长和朋友们，你们谦虚低调的风格、务实努力的工作态度、不厌其烦乐于助人的善良品格都是我学校的榜样。你们所给予的帮助和支持我都将铭记在心。首先我要衷心感谢导师郑培烝副教授多年来在学业上的精心培养和严格要求。您严谨求实的治学态度，不断求索的科学精神、广博的知识、独特的思维角度是我一生学习的楷模，对我的成长和进步将产生巨大而深远的影响，将使我受益终生。衷心感谢福建医科大学附属协和医院检验科主任曹颖平教授、王梅华副教授，微生物室黄心宏、潘玉红等老师，在课题研究过程中给与的指导与帮助。衷心感谢福建医科大学附属协和医院检验科PCR室周文娟、张旸和卢聘霞等师兄师姐，以及邹红、徐小红、吴娟、张娅和林伯熙等师姐师妹师弟在课题研究过程中给与的帮助与关怀。衷心感谢我的父母及读研期间关心支持我的朋友和同学。衷心感谢所有的论文评阅人和答辩委员会成员，你们严谨的治学态度，渊博的知识，提出的宝贵意见将促使我不断完善，今后进一步深入研究。70