mir-33a通过twistet-1信号级联通路调控骨肉瘤耐药的分子机制研究

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1、万方数据中图分类号R738．1UDC610博士学位论文学校代码lQ533miR．33a通过TWIST／ET-1信号级联通路调控骨肉瘤耐药的分子机制研究ResearchonthemolecularmechanismofmiR-33amodulatesosteosarcomachemoresistanceviaTWIST／ET-1signaling作者姓名：学科专业：研究方向：学院(系、所)：指导教师：副指导教师：论文答辩日期■DI￥、岁．『7一l周勇临床医学外科学湘雅三医院黄祖发张朝跃答辩委员会主中南大学2014年5月万方数据学位论文原创性声明本人郑重声明，所呈交的学位论

2、文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。⋯名：拉嘲扭￡月7日学位论文版权使用授权书本学位论文作者和指导教师完全了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定：即学校有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子版；本人允许本学位论文被查阅和借阅；学校可以将本学位论文的全部或部分内容编

3、入有关数据库进行检索，可以采用复印、缩印或其它手段保存和汇编本学位论文。保密论文待解密后适应本声明。导师签醐：型咂月半日产一0一监一L旦名九一躲趁者期万方数据miR．33a通过TWIST／ET-1信号级联通路调控骨肉瘤耐药的分子机制研究摘要第一部分TWIST过表达及干扰稳定细胞系的构建目的：针对不同骨肉瘤细胞中TWIST的表达水平差异，分别构建稳定高表达TWIST基因和稳定干扰TWIST基因的骨肉瘤细胞系，用于后续的功能研究。方法：采用基因克隆构建TWIST真核表达载体pCDNA3．1(+)．TWIST，转染骨肉瘤细胞Saos一2细胞，G418筛选稳定表达细胞系，Wes

4、ternblot检测获得TWIST稳定高表达细胞系Saos．2．TWIST细胞；采用TWISTshRNA慢病毒感染骨肉瘤MG63细胞，嘌呤霉素筛选，Westemblot检测获得稳定干扰TWIST的细胞系MG63一TWIST-shRNA。结果：分别采用限制性酶切分析、测序鉴定证实，成功构建了重组表达载体pCDNA3．1(+)．TWIST。分别经G418和嘌呤霉素筛选的细胞系，采用Westemblot检测，Saos．2．TWIST细胞可稳定高表达TWIST，而MG63一TWIST-shRNA中有效抑制TWIST的表达，干扰率80％以上。结论：成功构建TWIST稳定高表达和稳

5、定干扰细胞系，并经Westernblot鉴定符合预期要求。图9幅，参考文献7篇。关键词：骨肉瘤；TWIST；TWISTshRNA慢病毒；Saos．2细胞；MG63细胞分类号：R738．1万方数据第二部分TWIST与ET-1及ETAR受体信号的相互作用对顺铂作用下的骨肉瘤细胞生存率的影响研究目的：探讨TWIST和ET-1／ETAR信号的相互作用对于骨肉瘤顺铂耐药性的影响及可能的作用机制。方法：1．分别采用RealtimePCR、Westernblot、ELISA检测不同TWIST表达水平的骨肉瘤细胞中ET-1的表达情况，并检测P13K抑制剂LY294002对TWIST和E

6、T-1表达的影响；2．Tunel检测TWIST稳定高表达和干扰细胞系在采用P13K抑制剂LY294002和ETAR抑制剂BQl23处理后细胞对顺铂的凋亡率变化；Westernblot检测骨肉瘤细胞在P13K抑制剂LY294002处理后P．AKT的表达水平。结果：1．Saos．2细胞高表达TWIST导致ET-lmRNA和蛋白表达水平显著降低，而MG63细胞中抑制TWIST表达后ET-1的表达上调；此外，P13K抑制剂LY294002可致使骨肉瘤细胞中ET-1表达显著下调；2．TUNEL检测发现，Saos一2细胞中高表达TWIST将导致细胞对顺铂的凋亡率显著增加，而这一趋势

7、可通过外源添加ET-1(100pM)蛋白而被扭转；此外，选择性ETAR抑制剂BQl23可以完全阻断ET-1的反调作用，而LY2904002可部分阻断这个效果；另一方面，MG63细胞中下调TWIST蛋白的表达显著降低了细胞凋亡率，而这一效应可被BQl23或者LY294002所抑制；3．Westernblot检测结果显示，Saos．2细胞中高表达TWIST显著降低了磷酸化AKT(Ser473)的表达水平，而LY294002作用后，磷酸化AKT(Ser473)下降更为显著，而在MG63细胞中，下调TWIST后，磷酸化AKT(Ser473)的表达