mtor信号通路调控胶质瘤干细胞自我更新和替莫唑胺耐药分子机制的研究

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1、中山大学博士学位论文mTOR信号通路调控胶质瘤干细胞自我更新和替莫唑胺耐药的分子机制研究姓名：付军申请学位级别：博士专业：肿瘤学指导教师：陈忠平20090525中山大学博士学位论文mToR信号通路调控胶质瘤千细胞自我更额和替莫唑胺耐药的分子机制研究mTOR信号通路调控胶质瘤干细胞自我更新和替莫唑胺耐药的分子机制研究中文摘要目前，高级别胶质瘤的总体治疗效果仍不理想，生存期短，复发率及死亡率高，特别是胶质母细胞瘤的平均牛存时间还没有超过一年。替莫唑胺是近年来高级别脑胶质瘤化疗推荐药物。虽然替莫唑胺能延长患者无进展生存时问，但对整体生存期改善极为有限。

2、如何进一步提高高级别胶质瘤的化疗效果，延K患者生存时间已成为目前神经肿瘤的重点研究方向。胶质瘤干细胞是胶质瘤的种子细胞，在肿瘤的发生、发展过程中起决定性作用，也是胶质瘤对化疗产生耐受以及复发的根源。肿瘤干细胞能凭借其自身更新能力和处于静止期的特性，逃脱药物杀伤作用，从而在放化疗后导致肿瘤的复发。针对胶质瘤干细胞自我更新的相关分子机制研究，是阐明其致瘤原理的关键环节，并将为开发有效治疗胶质瘤的药物提供明确的切入点。mTOR(mammalJantargetofrapamycin)信号通路整合生长因子，营养，能量和应激信号，调控蛋白质合成，细胞生长和增

3、殖。mTOR信号通路异常活化和高级别胶质瘤的发生以及预后不良相关。临床研究表明，mTOR抑制剂能够延长复发胶质母细胞瘤患者牛存时间。目前，有关mTOR信号通路调控胶质瘤干细胞自我更新的研究报道甚少。mTOR信号通路能否调控胶质瘤干细胞自我更新和分化?该通路是否和胶质瘤干细胞对替莫唑胺耐药有关?本研究围绕胶质瘤干细胞自我更新这一热点领域，探讨mTOR信号通路调控胶质瘤干细胞自我更新和替莫唑胺耐药相关分子机制。中山大学博士学位论文roTOR信号通路调控胶质瘤干细胞自我更新和替莫唑胺耐药的分子机制研究第一部分胶质瘤干细胞分离、体外培养、鉴定和异种肿瘤移

4、植模型目的：从人脑胶质瘤组织和细胞株中分离脑胶质瘤干细胞、进行体外培养并鉴定其生物学特性，以及制作异种肿瘤移植模型。方法：采用以CDl33免疫磁珠分选技术从人腑胶质瘤组织和细胞系SKMG一4中分离脑胶质瘤干细胞并进行体外无血清培养，通过免疫荧光技术检测分子标志物CDl33、Nestin、Sox-2以及谱系分化标志物TuJl和GFAP；建立裸鼠皮下和脑原位移植模型研究胶质瘤干细胞的致瘤性。结果：经CDl33免疫磁珠分选的CDl33+细胞群在胶质瘤干细胞培养液中呈悬浮生K，培养24--一48小时，可见肿瘤球，能连续传代并保持较好的增殖牛长能力；胶质瘤

5、干细胞培养液培养的CDl33一细胞群中大部分细胞呈贴壁生长，未见明显肿瘤球形成，一般无法继续传代培养或仅能传l～2代。免疫荧光染色结果表明，来源于0814、0816、0508和SKMG-4的肿瘤标本经CDl33分选后培养的胶质瘤干细胞高表达神经干细胞标记CDl33、Nestin和Sox一2，其中CDl33染色的阳性细胞率分别为88．2±4．5％、78．3±5．2％、90．3±4．6％和85．6±5．5％，Nestin为95．5±5．5％、85．2±4．8％、96．2±5．2％和90．6±4．8％；分化谱系标记GFAP和TuJl表达较低，着色细胞含

6、量均低于10％。CDl33和Nestin免疫染色较强的细胞丰要分布于肿瘤球表面。不同数量的CDl33+胶质瘤干细胞(103个)和CDl33一胶质瘤细胞(105个)注射于BALB／C裸小鼠背侧皮下，处死动物解剖检视，结果表明，来源于SKMG一4、0814、0816和0508的胶质瘤于细胞皮下注射103个细胞均能成瘤；105个CDl33’胶质瘤细胞移植后8周，裸鼠皮下亦未见明显肿瘤形成。胶质瘤干细胞颅内移植后4周，分离取得裸鼠脑组织后行冰冻切片和H&E染色，移植瘤与亲本肿瘤HE染色观察比较，其病理表犁与亲本肿瘤一致。结论：人脑胶质瘤组织和胶质瘤细胞株

7、中存在的少量CDl33+胶质瘤细胞是胶质瘤干细胞。中山大学博士学位论文mTOR信号通路调控胶质瘤千细胞自我更新和替莫唑胺耐药的分子机制研究第二部分mTOR信号通路调控胶质瘤干细胞自我更新的分子机制研究目的：研究roTOR信号通路调控胶质瘤干细胞自我更新相关的分子机制方法：Westernblot检测mTOR信号通路组分P—S6K、p-S6和干细胞自我更新相关基凶Bmi-1的表达水平；建立ETOR通路干预模型：激活模型(慢病毒导入Rheb基因)和卜．调模型(Rapamycin，RPA)，肿瘤球形成试验评价干预mTOR信号通路对胶质瘤干细胞自我更新的影

8、响；建立Bmi一1慢病毒shRNA干预模型，肿瘤球生成试验检澳1]Bmi-1基冈沉默对胶质瘤干细胞自我更新的影响；免疫荧光检测CDl33