zfp580调控enosno信号通路促进epcs分化的分子机制研究

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1、分类号：R54学校代码：10062密级：学号：2012602630硕士学位论文MASTER’SDISSERTATION论文题目：ZFP580调控eNOS/NO信号通路促进EPCs分化的分子机制研究TITLENovelzincfingergeneZFP580promotesEPCsdifferentiationviaeNOS/NOpathway一级学科：临床医学二级学科：内科学心血管病论文作者：黄佳雯指导教师：张梅张文成天津医科大学研究生院二〇一五年五月分类号：R54学校代码：10062密级：学号：2012602

2、630学位类别：科学学位专业学位学科门类：医学硕士学位论文MASTER’SDISSERTATION论文题目：ZFP580调控eNOS/NO信号通路促进EPCs分化的分子机制研究TITLENovelzincfingergeneZFP580promotesEPCsdifferentiationviaeNOS/NOpathway一级学科：临床医学二级学科：内科学心血管病论文作者：黄佳雯指导教师：张梅教授导师组成员：张文成教授天津医科大学研究生院二〇一五年五月学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导

3、师指导下独立进行研究工作取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容和致谢的地方外，论文中不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文，并编入有关数据库。

4、保密，在年解密后适用本授权书。本论文属于不保密。（请在相对应的方框内打“√”）学位论文作者签名：日期：年月日导师签名：日期：年月日天津医科大学硕士学位论文中文摘要目的：内皮功能紊乱是心脑血管病重要的病生理基础。加速血管损伤后再内皮化和血管新生，是预防及治疗心血管病的关键。内皮祖细胞(endothelialprogenitorcells,EPCs)参与血管内皮修复及血管新生，EPCs的归巢、增殖及分化受多种转录因子调控网络的影响，其机制尚未阐明。本实验旨在研究新型C2H2锌指蛋白基因ZFP580调控EPCs分化的

5、分子机制，为深入研究ZFP580的生物学功能提供实验依据，为治疗血管性疾病提供新的治疗策略和靶点。方法：①密度梯度离心法，分离培养大鼠骨髓源性EPCs，免疫荧光染色及流式细胞技术(FACS)鉴定EPCs；②体外诱导培养EPCs，观察EPCs在0d、4d、7d、14d细胞形态的动态改变；免疫荧光染色检测eNOS在相应时间点的表达变化；流式细胞技术检测EPCs分化表面分子标记物的动态改变；QPCR及Westernblot检测相应时间点ZFP580mRNA和蛋白表达水平的变化；③腺病毒转染技术获得过（低）表达ZFP5

6、80的EPCs，QPCR、Westernblot、流式细胞技术及体内外血管形成实验等方法检测ZFP580对EPCs分化及血管生成能力的影响；④Ad-ZFP580及Ad-siZFP580转染EPCs，观察ZFP580对其下游靶基因eNOS表达的影响，应用eNOS抑制剂L-NAME，探讨eNOS/NO信号通路在ZFP580介导的EPCs分化过程中的作用。结果：分离培养的EPCs在3~4d时，光学显微镜下可见部分贴壁细胞集落样生长，呈圆形或不规则形；7~10d，贴壁的梭形细胞从细胞团边缘出芽生长；14~21d可观察到

7、梭形细胞首尾相连成条索状结构，梭形细胞基本融合，融合后逐渐呈铺路石状。细胞培养至7d时，Dil-acLDL/FITC-UEA-I双阳性细胞约占87.39±2.98%，免疫荧光及FACS结果显示：CD31、CD34和VEGFR-2表达阳性。以上结果说明所培养细胞是EPCs。FACS检测EPCs的分子表面标志物的表达变化，结果显示：随着EPCs的分化，干细胞表型CD133逐渐减低，而成熟ECs表型逐渐增高；同时，ZFP580及eNOS在EPCs的分化过程中均呈动态表达。腺病毒转染技术获得过（低）表达ZFP580的E

8、PCs，ZFP580过表达促进成熟内皮表型CD31、vWF、eNOS的表达，降低干细胞表型CD133的表达，同时，体内外血管生成能力增强；而ZFP580低表达抑制成熟内皮表型CD31、vWF、eNOSI天津医科大学硕士学位论文的表达，增强干细胞表型CD133的表达，同时，体内外血管生成能力减弱。说明ZFP580可促进EPCs向成熟内皮细胞分化。应用eNOS抑制剂L-NAME后，显著降低