禽多杀性巴氏杆菌ptfa基因壳聚糖纳米dna疫苗的研究

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1、分类号UDC密级编号硕士学位论文禽多杀性巴氏杆菌PtfA基因壳聚糖纳米DNA疫苗的研究StudyOnthePtfANano-ChitosanVaccineAgainstAvianPasteurellamultocida学位申请人：孔梁宇指导教师：宫强副教授一级学科：生物学二级学科：生物化学与分子生物学学位类别：理学硕士2016年05月万方数据独创性声明本人声明，所呈交的论文是我个人在导师指导下完成的研究工作及取得的研究成果。据我所知，文中除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得

2、河南科技大学或其它教育机构的其他学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：日期：关于论文使用授权的说明本人完全了解河南科技大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校拥有对所有学位论文的复制权、传播权、汇编权及其它使用权（特殊情况需要保密的论文应提前说明，但在解密后应遵守此规定）。需要保密的论文请填写：本学位论文在年月至年月期间需要保密，解密后适用本授权书。（需要保密的学位论文无须向图书馆提供论文的电子文档）研究生签名：导师签名：日期：万方数据摘要摘

3、要禽多杀性巴氏杆菌是引起食源性动物呼吸道感染的一种重要的病原菌，给养殖业造成了巨大的经济损失。目前，控制禽巴氏出血症的疫苗主要有灭活疫苗和减毒活疫苗。但这些传统疫苗的保护效果并不理想。DNA疫苗制备方便、结构稳定，可在动物体内持续诱导体液免疫与细胞免疫应答。壳聚糖是一种生物可降解性的天然多糖，可保护DNA免受核酸酶的降解，在基因转导方面有巨大的潜力。因此壳聚糖DNA纳米疫苗成为当前DNA疫苗的研究热点。PtfA基因编码的IV型鞭毛蛋白是禽巴氏杆菌重要的毒力因子，本试验以该基因为研究对象，通过PCR扩增该基因，采用BamHⅠ

4、、EcoRⅠ进行双酶切，并将其导入真核表达载体的多克隆位点，构建并扩增该重组质粒，与0.02%的壳聚糖溶液混合，通过复凝聚法制备壳聚糖-PtfA纳米疫苗。采用凝胶阻滞试验、透射电镜观察，确定最佳N/P比；将该疫苗免疫小鼠，间接ELISA法检测小鼠血清抗体水平、MTT法外周血淋巴细胞增殖率、试剂盒法测定IFN-γ分泌水平及该疫苗的免疫保护率。试验结果表明，以N/P比为2.5制备的壳聚糖-pcDNA3.1(+)/PtfA纳米颗粒，85%的颗粒呈规则的球状，包封率高、大小均一，其粒径在200nm左右；免疫后，壳聚糖-重组质粒组、

5、重组质粒组小鼠血清抗体水平、淋巴细胞增殖率含量显著高于生理盐水组、空载体组及其壳聚糖复合物组（p<0.01），且壳聚糖-重组质粒组略高于重组质粒组；这两组IFN-γ含量分别达到了359.31ng/L、310.14ng/L，极显著高于另外三组；攻毒后，壳聚糖-重组质粒组的免疫保护率达到了75%，显著高于其它四组。表明本试验已成功构建出壳聚糖-pcDNA3.1(+)/PtfA纳米DNA疫苗，为禽巴氏杆菌病的治疗奠定了一定的基础。关键词：PtfA-pcDNA3.1(+)；壳聚糖；复凝聚法；纳米颗粒；免疫；保护率论文类型：应用基础

6、研究选题来源：河南省教育厅科技重点研究项目(12A180009)；河南科技大学青年科学基金项目(2012QN002)I万方数据ABSTRACTABSTRACTAvianPasteurellamultocidaisoneofthemostimportantpathogensinfood-producinganimalsinvolvedintherespiratorytractinfections,whichhasbroughtsevereeconomiclosstothebreedingindustry.Currently,

7、thevaccinesconstructedtocontrolavainpasteurellosismainlycontaininactivatedvaccinesandattenuatedvaccines.However,theprotectiveefficacyofthesetraditionalvaccinesarenotideal.DNAvaccinehasbecomeaveryattractiveapproachfortriggeringasustainablehumoralandcellularimmunere

8、sponsesinanimals.ThequalityofDNAvaccineisstableandeasytocontrol.Chitosan,anaturalpolysaccharidewithbiologicaldegradability,hasagoodprospectintermsofgene