牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌疫苗候选株的筛选.pdf

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1、分类号：密级：公开学号：2015201721单位代码：10759石河子大学硕士学位论文牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌疫苗候选株的筛选学位申请人朱玲指导教师剡根强教授申请学位门类级别农学硕士学科、专业名称预防兽医学研究方向动物传染病诊断与防治所在学院动物科技学院中国·新疆·石河子2018年6月SelectionofcandidatestrainsofbovinePasteurellamultocidaAvaccineADissertationSubmittedtoShiheziUniversityInPartialFulfillmentoftheRequirementsFortheDegree

2、ofMasterofAgricultureByZhuLing(PreventionVeterinaryMedicine)DissertationSupervisor:Prof.YanGen-qiangJune,2018石河子大学学位论文独创性声明及使用授权声明学位论文独创性声明本人所呈交的学位论文是在我导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确的说明并表示谢意。研究生签名：时间：年月日使用授权声明本人完全了解石河子大学有关保留、使用学位论文的规定

3、，学校有权保留学位论文并向国家主管部门或指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权将学位论文在学校图书馆保存并允许被查阅。有权自行或许可他人将学位论文编入有关数据库提供检索服务。有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。研究生签名：时间：年月日导师签名：时间：年月日摘要目的：为了能够筛选出生长快、毒力强、免疫原性好、副反应小的牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌（Pasteurellamultocida,Pm）灭活苗候选菌株，本试验选取6株经分离和鉴定的来自新疆不同地区发病牛场，导致犊牛肺炎而死亡的牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌分离株，对其进行生长曲线测定，药物敏感性试验，小鼠

4、毒力测定，菌体脂多糖（LPS）含量测定，各菌株灭活苗免疫小鼠、家兔后抗体测定、攻毒保护试验以及犊牛免疫效果测定。方法：试验一：不同Pm分离株生长特性、菌体LPS含量以及药物敏感性测定。将6株分离株的纯培养物进行革兰氏染色与镜检，观察染色及形态特征，确保各菌株为纯培养物。采用活菌计数法（CFU）和菌液吸光度（OD值）的方法检测6株菌生长曲线并进行比较；用LPS提取试剂盒分别提取6株分离株的LPS，分别测定6株分离株LPS的核酸含量、多糖含量、蛋白含量；采用纸片法对6株分离株进行药物敏感性测定。试验二：不同Pm分离株毒力基因及小鼠致病性测定提取不同Pm分离株的DNA，参照与荚膜形成相关基因c

5、eaA基因、细菌黏附相关基因fimA基因、四型菌毛相关基因ptfA基因以及与铁获得因子相关基因tbpA基因序列设计特异性引物分别进行PCR扩增；采用小鼠腹腔注射法，对6株Pm菌株进行小鼠半数致死量（LD50）测定。试验三：不同Pm分离株灭活菌苗的制备及免疫效果测定灭活菌苗的制备：将6株分离株分别进行扩大培养，活菌计数，经甲醛灭活后，用ISA206双相佐剂制备Pm灭活油佐剂疫苗，对所制备菌苗进行无菌检测、物理性状的检测、疫苗的稳定性检测、疫苗保存时间试验、动物安全性试验等检测；小鼠、家兔动物免疫效果测定：将制备的6株灭活苗分别皮下免疫小鼠及家兔后观察小鼠和家兔的食欲，精神状况，以及家兔体温

6、变化，二免后14d采用已建立的IHA方法对免疫小鼠、家兔的血清进行抗体测定；犊牛免疫效果测定：选择小鼠、家兔血清抗体效价较高的分离株灭活苗进行犊牛免疫试验；观察并记录免疫犊牛健康状况，并于二免14d采集犊牛血清进行抗体检测。结果：1.六株Pm分离株的生长曲线相似，其中Pm2、Pm3、Pm5分离株生长较快；Pm1、Pm4、Pm6分离株生长较慢。Pm3分离株LPS中的核酸含量、多糖含量、蛋白含量最高，Pm5、Pm2菌株含量次之；其余菌株含量较少。药物敏感性试验表明：6株分离株对同种药物的敏感性相似，都对庆大霉素、氧氟沙星的敏感性较高，对新霉素、环丙沙星的敏感性不高,对氨苄西林钠几乎不敏感。2

7、.毒力因子检测表明，6株分离株均含四型菌毛相关基因ptfA与黏附相关基因fimA；小鼠半数致死量（LD3.171.971.7250）测定表明分离株Pm1、Pm2、Pm3、Pm4、Pm5、Pm6的LD50分别为10、10、10、102.30、101.89和102.52CFU/mL。其中Pm3菌株毒力最强；3.所制灭活菌苗无杂菌污染、粘度符合要求、离心后无分层、稳定性良好；小鼠、家兔免疫保护性试验结果显示：Pm2、Pm3、Pm5分离株制