禽多杀性巴氏杆菌crp、phop基因的功能研究及其突变株免疫效力的初步评价

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1、分巧吗Ｓ８５８．３２举号Ｓ２０口巧１２四川农业大学硕±学位论文禽多杀性己巧杆菌ＣＷ、戶基因的功能研究及其突变株免疫效力的初步评价Ｉ肖康鹏指导教师孔巧科研究员学科专业稀防兽展举研巧方向微生物与免巧学二〇—五年六月Ｃｌａｓｓｉｆｉｅｄｃｏｄｅ：Ｓ８５８．３２Ｓｔｕｄｅｎｔｎｕｍｂｅｒ：Ｓ２０１２３５１２ＳｉｃｈｕａｎＡｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｇｙＭ＇ａｓｔｅｒｓＤｅｒｅｅＤｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎｇＦｕｎｃｔｉｏｎａｌｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆｃ巧？ａｎｄ少片０戶

2、ｇｅｎｅｉｎａｃａｉｎＰａｓｅｕｒｅｌｌａｍｕｌｔｏｃｉｄａａｎｄｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｔｈｅｄｅｌｅｔｉｏｎｏｎｉｍｍｕｎｏｅｎｉｃｉｔｙｇＸｉａｏＫａｎｅｎｇｐｇＤｉｒｅｃｔｅｄｂｙ：Ｐｒｏｆ．ＫｏｎｉｎｋｅｇＱｇＪｕｎｅ２０１５，论文独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的成果。尽我所知，除了文中特别加Ｗ标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它教育机构的

3、学位或证书所使用过的材料一。与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名１：０月巾味＠名１户关于论文使用授巧的黄明本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部口或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可Ｗ采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可Ｗ用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。＼２□本论文保密，在本授权。Ｊ＾论文不保密。＿年解密后适用＂＂（请在上□内划Ｖ）研究生签名：ｔ永觀

4、部护告月少＾导师签名：々＂年月日术奸石／乂摘要多杀性巴氏杆菌是能引起多种动物致病的革兰氏阴性菌。现有研究表明，Ｗ全局调控基因ＣＷ或如为鞭基因在大肠杆菌或紗口氏菌进行疫苗开发研究卓。有成效然而，在多杀性己氏杆菌中对这两个基因的相关研究还相当匿乏，基于此，我们的研究结果如下：１、潜在基因的筛选鉴定：将潜在的多杀性巴氏杆菌ＣＷ、如〇巧含两段潜在序列，分别命名为抑０戶／和抑０戶巧基因分别克隆至低拷贝质粒ＰＹＡ３３３２后引入沙口氏菌相应突变株，利用麦康凯显色试验成功鉴定多杀性己氏杆菌ＣＴ／７基因，利用Ｘ－Ｐ平板显色试验和多粘菌素Ｂ抗性试

5、验确定抑〇尸２基因为真正的多杀性己氏杆菌如ｏｆ基因。同时，制备了Ｃｒｐ和ＰｈｏＰ的兔源多克隆抗体；２、突变株构建；通过自杀质粒ＰＹＡ４２７８介导的同源重组方法，成功地构建Ｗ＊的禽源多杀性巴氏杆菌伯ｅｗｅ化化ＪＣ加！ＯＤＹ１２０８１８株／？＆〇／基因缺失－己氏株。两基因缺失株均遗传稳定性良好。根据后续试验需要，基于大肠杆菌－ｅｘｒｅｓｓ功地构建加杆菌科穿梭质粒ｐＭＣｐ，成（０ＤＹ１２０８１８Ｃ／７？基因缺失株的互补株；３、生物学功能鉴定：多杀性己氏杆菌缺失ＣＷ基因后，茵株的生长速度明显减缓，对部分碳源和氨基酸代谢能力改变；表型特征（外

6、膜蛋白和脂多糖图谱）无明显变化，对鸭血清的敏感性显著升高，在维鸭模型中通过曰服途径和滴鼻途２２８６Ａｏ戶基径攻毒，毒为分别较野生株降低了倍和倍；多杀性己氏杆菌缺失ｐ因后，苗株的生长速度、代谢能力、表现特征和血清敏感性均无明显变化，在维鸭模型中测定力通过口服途径和滴鼻途径攻毒，毒力分别较野生株降低了３２倍和１５４倍；４、免疫俱护力测定／ｔｏｃＷａＤＹ１２０８１８Ａｃ／，！錐鸭经滴鼻免疫片／ｍ／ｐ株活菌或经口服免疫Ｐ胃化？化虹ＤＹ１２０８１８Ａ如ｏｆ株活菌，用野生株攻毒，分别能达到６０％和５４．５％的保护效力。然后，采用／ｍ＜／ｆｏｃＷ

7、ａＤＹ１２０８１８野生型灭活全菌菌体或外膜蛋白分别检测免疫后维鸭血清ＩｇＹ和胆汁ＩｇＡ水平，均能检测到较强的体液免疫和粘膜免疫应答水平；５、转录组测序分析：在相同培养条件下，对禽多杀性巴氏杆菌／＾／？？化向沁ＤＹ１２０８１８野生型，ＣＴ，和如ｏｆ基因缺失株分别进行转录组测序，Ｗ野生型数据Ｉ，ｃｒ、？Ａ１８６、３３４个差异表达基因为对照分别在ｐ；ｏｆ基因缺失株中得到个；通过对这些差异表达基因进行包括ＧＯ功能注释、ＫＥＧＧ通路在内的生物信息学分析，对多杀性己氏杆茜转录因子ｃｒｐ、抑〇户基因的调控功能得到初步了解