抗cd3%2f抗cd20双特异性单链抗体构建、表达及生物学活性检测

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1、中文摘要抗CD3／抗CD20双特异性单链抗体的构建、表达及生物学活性检测(中文摘要)BiTEs(bispecificTcellengagers)是以T细胞作为效应细胞的双特异性单链抗体，它采用单链抗体技术，将两个不同抗体的重链及轻链可变区连接在一条多肽链上，并作为活性蛋白在CH0细胞中进行分泌表达，其基本的形式是‰，一linker一‰t一1inker—v豫一linker—k。BiTEs具有两个抗原结合部位，可以同时和T细胞及病变细胞表面的抗原分子结合，从而有效地激活静止的T细胞来达到杀伤病变细胞的目的。抗cD3／抗cD20双特异性单链抗体是一种BiTEs形式的极具潜

2、力的新型工程抗体，它以CD20为靶标，具有靶向杀伤B细胞淋巴瘤的功能。本实验通过重叠延伸PCR扩增获得抗cD3／抗cD20双特异性单链抗体完整基因片段：前导序列一叫L。。～(G。s)广_vl{。一(G．s)广'Ⅶ。一(已S)3'叫b：广一(His)6-～。将上述片段连入瞬时表达载体pcDNA3．1及真核定点表达载体口cDNA5／FRT中，分别获得了瞬时表达及稳定表达质粒。目的基因在FlP-In“cHO细胞中获得稳定表达，其表达量约为300ug几培养上清。采用用Ni—NTA纯化系统进行对培养上清进行亲和层析，得到了纯度较高、分子量为59，5KD的目的蛋白。活细胞间接免

3、疫荧光法结果显示此抗体可以与表达cD3抗原的Jurkat细胞以及表达cD20抗原的Ramous细胞发生特异性结合，玫瑰花环实验显示该抗体在体外可诱导效应细胞聚集在靶细胞周围。扫描电镜观察和非放射性细胞杀伤检测实验证明抗CD3／抗CD20双特异性单链抗体可有效介导IL一2预激活的人外周血淋巴细胞杀伤8淋巴瘤细胞Ramous。在抗体浓度为5ug／ml，反应时间24h时，裂解活性随效靶比的升高而增加，在效靶比为10：l时杀伤活性最高可达87．3％；固定效靶比10：l时，杀伤活性随抗体浓度的升高和反应时间的增加而升高。Av／PI染色表明抗CD3／抗CD20双特异性单链抗体可

4、能介导T细胞主要以诱导细胞凋亡的方式来起到杀伤靶细胞的作用。采用基因芯片技术检测加药前后Ramous细胞凋亡相关基因的表达变化，推测该抗体介导的T细胞诱导靶细胞主要以ATM～p53途径发生凋亡。以上结果表明抗CD3／抗cD20双特异性单链抗体具有开发成为一种针对表达CD20抗原的B细胞淋巴瘤的新型治疗性抗体的潜力。关键词：cD20cD3双特异性单链抗体表达生物学活性英文摘要ExpressiOn，IdentincationandBiOactivityCharacterizatiOnofAnAnti—CD3，anti—CD20BispecmcSingle-ChaillA

5、ntibody(Abstract)BiTES(bispeecificTceUengagerS)isakindofbispecmcsillgle·chain肌tibodieswithmefo彻ationofVLl-li幽r．Vm-linkef'V磁-l№r-V也．ItnotomycanlinkTceUsandpanlogeniccells，butalsoc蛆ef&ientlysti删llatecytotoxicTcells棚induce组曙etcelldes缸11ctioⅡ．ne卸ti-CD3，ami—CD20bispeci＆sjngle．chain卸tibodyis

6、akindOfBiTEs，whichhasbeennlought雏姐p酿斌姐daC曲ctivecandidateinBcelllyⅡlphOma也erapy．Thesyn血eticgenewi也1640bpencodingfor也e纰i·CD3，柚ti-cD20bispecificsiIlgle—chaillaIltibodywasdesignedandab诅inedbySOE(splicingbyoverlapextension)PCR．ThecDNAwasc10nedintO“ansientexpressiOnvectorpcDNA3．1andR口一bTMexp

7、ressionVectorpcDNA5／FRT，thenseparatelytmsfecedintoCOS一7cellsfofatransientexpressinandF1p—InTMCHOceUstogenemteastableexpressioncelllinewithacapac“yforexpressiIlgami—CD3／anti—CD20bispecificsiIlgle—chainamibodiesat300肛g／L．Thcprotcin，whichhadam01ecuIarweightof59．5KD，wasp嘶fiedbyNj—NTAaffi