津田芜菁花青素合成非依光型t-dna突变体的构建及分析

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1、学位论文万方数据学校代码：10225学号：S13157津田芜菁花青素合成非依光型T-DNA突变体的构建及分析指导教师姓名：申请学位级别：论文提交日期：授予学位单位：刘明雪李玉花教授东北林业大学硕士学科专业：发育生物学2013年4月论文答辩日期：2013年6月东北林业大学授予学位日期：答辩委员会主席：李景富论文评阅人：郭长虹王晶英春童厶符素大学万方数据UniversityCode：10225RegisterCode：S13157DissertationfortheDegreeofMasterConstructionandAnalysisofthelightindependentan

2、thocyaninaccumulationT--DNAmutantin‘Tsuda’turnipCandidate：Supervisor：AcademicDegreeAppliedfor：Speciality：DateofOralExamination：University：LiuMingxueLiy西huaMasterDevelopmentbiologyJune，2013NortheastForestryUniversity万方数据摘要基因组学研究的一个重要手段是构建大规模突变体库，通过分析突变体的表型从而鉴定突变基因的功能是功能基因组学研究最直接有效的方法。T-DNA是目前使

3、用最广泛的插入元件，已在许多植物中利用其进行突变体库的构建和筛选，从而研究基因的功能。本研究组在前期的研究中发现，UV-A特异诱导津田芜菁膨大肉质根表皮的花青素合成，推测在植物中可能存在不同于UV_～蓝光受体的UV-A特异的受体。津田芜菁花青素合成非依光型T-DNA插入突变体的构建将为研究UV-A特异诱导花青素合成途径中相关基因及信号转导因子建立平台。本研究制作了津田芜菁花青素合成非依光型T-DNA突变群体并对突变群体进行了初步鉴定分析。得到了以下结果：成功从pBll21质粒中克隆了GUS基因，测序分析显示GUS基因序列全长1812bp，Blast序列比对显示序列正确。采用Gat

4、eway技术，成功构建了表达载体pH7WG2D，1．GUS,该植物表达载体含觎P选择性标记基因、GUS选择性标记基因、潮霉素植物选择标记以及CaMV35s启动子。以津田芜菁花序轴为外植体进行农杆菌介导的组培遗传转化探索，并根据芜菁难于再分化的特性设置了35种不同6-BA和NAA组合的分化培养基，结果表明此种方法不能使芜菁分化出再生芽。采用农杆菌真空渗透萌发种子的方法进行芜菁非组培遗传转化的探索，并设置了干种子未超声、干种子超声、浸泡种子未超声、浸泡种子超声四种实验条件。绿色荧光蛋白筛选及GUS组织化学染色初步鉴定表明浸泡种子超声的转化率最高，阳性结果达到60％。对T-DNA插入突

5、变体库进行筛选，获得花青素合成不受光诱导的全红突变体以及花青素不合成的全白突变体。通过筛选约10000株Tl代津田芜菁，获得200株系目标突变体。种植筛选出的T2代突变体，共获得17个全红株系，60个全白株系。对转基因植株进行了gfp、gus、hyg和35sprmoter四个标记基因的PCR鉴定。其中全红表型突变体3、4号，全白表型突变体7、9号四个标记基因PCR结果均有条带。经眦L—PCR分析，T-DNA插入位点在07号染色体的20002828位置和20003156位置之间，可能在两个基因之间或下游基因的启动子区。对插入位点上下游基因进行分析，发现其上游基因为三角状五肽重复区(

6、pentatricopeptide，PPR)，下游基因编码的蛋白属多药和有毒化合物排出家族(MultidrugandToxicCompoundExtrusion，MATE)。关键词芜菁；花青素；T-DNA插入突变体万方数据AbstractTheconstructionoflarge-scalemutantlibraryisanimportantcontentoffunctionalgenomicsresearch．Analysisofthemutantphenotypeandidentificationofthegenefunctionarethemostdirectandeff

7、ectivemethodoffunctionalgenomicsresearch．Inrecentyears，usingT-DNAasaninsertelementtobuildmutantlibrary,screenmutantandresearchgenefunctionhasbeenfoundinmanyplants．Intheearlystudies，theresultsshowedthatanthocyaninsynthesisof‘Tsuda’turnipwasspe