甘蔗梢腐病菌t-dna插入突变体库的构建和分析

《甘蔗梢腐病菌t-dna插入突变体库的构建和分析》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、甘蔗梢腐病菌T-DNA插入突变体库的构建和分析摘要甘蔗梢腐病是世界范围内重要的经济作物真菌性病害，其病原真菌为轮枝镰孢菌(F．verticillioides)和层出镰刀菌(F．proliferatum)。通过农杆菌介导的遗传转化分别构建了这两个镰刀菌种(菌株CNO．1和YN41)的突变体库，并利用高效TAIL．PCR和菌落形态对突变体库进行鉴定。结果分别构建了库容量为195的YN41突变体库和库容量为956的CNO一1突变体库。从两个突变体库中分别随机挑选6个转化子，进行PCR鉴定，结果均为阳性。通过菌落特征和致病性筛选YN41和CNO。1突变体库，鉴定出生长速度减慢且

2、致病力下降突变体1个(A5)，生长速度减慢且致病力不变突变体1个(C8)，生长速度加快且致病力增强突变体2个(A1、A2)，菌丝变浓密且菌丝疏水性变弱突变体1个(A3)；采用高效TAIL．PCR对这些转化子的T-DNA侧翼序列进行扩增，获得了A1、A2、A3突变体的T-DNA侧翼序列，通过BLAST鉴定到其插入位点(下游)基因，这些基因分别与色氨酸加氧酶和苯丙氨酸解氨酶等有关。CNO一1突变体库中，筛选出生长速度减慢突变体23个，色素变异突变体1个；对47株突变体进行高效TAIL．PCR，扩增插入位点侧翼序列，得到有效序列22条，BLAST结果显示，T-DNA的22个插

3、入位点分布在CNO．1的15条基因组scaffold上；对插入位点(下游)基因进行分析，结果显示，生长速度减慢突变体的插入失活基因分别与细胞分裂、DNA修复、△12脂肪酸脱氢酶、E3泛素连接酶等有关。关键词：遗传转化，插入突变体库，表型变异，侧翼序列矗·j万方数据CONSTRUCTIONANDANALYSISOFT-DNAINSERTIONALⅣ叮TANTLIBRARIES0FFUSARIUMSPECIESCAUSEDSUGARCANEPOKKAHBOENGSUGARCANEABSTRACTSugarcanepokkahboengisaneconomicallyimpo

4、rtantfungaldiseaseworldwide，whicharecausedbytwospeciesofFusarium，F．verticillioidesandF．proliferatum．TwoT-DNAinsertionalmutantlibrariesofthesetwoFusariumspecies(isolateCNO一1andYN41)weregeneratedbyAgrobacteriumtumerfaciensmediatedtransformation(ATMT)andanalyzedbyHiTAIL—PCRandfungalcharacte

5、rizations．Theresultsindicatedthattwolibraryof195and956insertionalmutantsweregeneratedfromisolateYN41andCNO一1，respectively．SixmutantswererandomlyselectedfromeachlibraryandidentifiedtobepositivebyPCRamplification．FromYN41library,fivemutantswereidentifiedbyfungalcharacterizationandpathogeni

6、city,includingonemutant(A5)withslowergrowthphenotypeandlowerpathogenicity；onemutant(C8)withslowergrowthbutlessdifferentpathogenicity；twomutants(A1andA2)withmoregrowthandhigherpathogenicity；onemutant(A3)withdensermyceliumandweakerhydrophobicability．Theflankingsequencesofll万方数据T-DNAfromthe

7、mutantsA1，A2andA3wereamplifiedandsequencedbyHiTAIL—PCRandthenidentifiedtobeassociatedwiththegenesencodedtryptophandioxygenaseandphenylalanineammonialyasebyBLASTsearch．FromCNO一1library，23mutantsdecreasedtheirgrowth，andonechangeditsclonypigment．Twenty-twoflankingsequenceswe