mfn2对低氧肺动脉平滑肌细胞影响及其机制探讨

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1、中图分类号UDCR543．2610硕士学位论文学校代码密级10533Mfn2对低氧肺动脉平滑肌细胞影响及其机制探讨EffectofMfn2onhypoxiapulmonaryVascularsmoothmuslecellsanditsunderlyingmechanism作者姓名：方霞学科专业：临床医学研究方向：老年医学(呼吸)学院(系、所)：湘雅医院指导教师：陈琼教授论文答辩日期—冽叫．答辩委员会主席中南大学二零一三年五月一奄一二，牛血月原创性声明Ⅲ舢Ⅷ㈣圳圳Ⅲ删㈣洲Y2423761本人声明，

2、所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。作者签名：学位论文版权使用授权书本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采

3、用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。醐：碰年j月牛硕士学位论文中文摘要摘要背景：肺动脉高压(pulmona巧arterialhypertension，PAH)是一种血管壁细胞过度增殖，最终导致肺细小动脉管腔阻塞的循环疾病。低氧性肺动脉高压(hypoxicpulmona巧hypertension，}玎)H)是肺动脉高压(pulmona珂arterialhypertension，PAH)中最

4、常见类型。如PH的发生、发展病理生理主要包括低氧性肺动脉收缩(hypoXicpulmona巧arte巧vasoconstriction，}PV)和低氧性肺血管重建(1卵oxicpulmona巧vascularremodeling，Ⅷ’VR)。我们知道Ⅷ’Ⅵ己最重要的病理特征是肺动脉平滑肌细胞(pulmona巧arterialsmoothmusclecells，PASMCs)增殖和肥大，然而其发生机制目前尚不清楚。线粒体融合蛋白2(mitomsill2，M勉)不仅是维持线粒体正常形态和调控线粒体融

5、合的重要元素，同时也是细胞内重要的信号转导分子，特别是在细胞增殖、细胞凋亡通路中具有重要作用。研究发现M勉可以抑制P13K／Al(t信号通路，使线粒体外膜通透性增高，激活线粒体凋亡途径，细胞色素C大量释放，激活下游Caspase级联反应，促进血管平滑肌细胞(vascularsmootllmusclecellsVSCMs)凋亡。Mfh2在心血管疾病中，对VSMCs增殖作用已有较深入研究，但在肺动脉高压中的研究甚少。我们有理由认为M舵既然在心血管疾病VSCMs增殖中发挥重要的作用，那么其对卸，H中P

6、ASMCs很可能具有同样作用。目的：本研究探讨M勉在Ⅷ?H模型大鼠肺组织表达情况及其在PASMCs增殖凋亡失衡中发挥的作用，并进一步研究Mfh2在此过程中对P13眦信号通路及线粒体凋亡途径的影响。方法：第一部分：在体动物实验(1)随机将20只SD大鼠平均分为常氧组和低氧组，低氧组大鼠每天放在氧浓度为(10土O．5)％的自制有机玻璃箱(O．8m×O．55m×O．40m)中饲养，每天连续低氧8h，共4周，常氧组在正常氧浓度(氧浓度2l％)与低氧组大鼠同等饲养条件II硕士学位论文中文摘要下饲养；(2)

7、卸)H模型大鼠复制成功后，通过测量大鼠肺功能、肺动脉平均压、RⅧ(rightVen仃icularhypenrophyindex，右心室肥大指数)鉴定}玎，H模型；(3)逆转录ImPCR及免疫印迹fW

8、estemB10t、WB)技术检测正常及}玎?H模型大鼠M趾mRNA及蛋白表达，WB技术检测增殖细胞核抗原(pr01iferatingcellnuclearantigen，PCNA)蛋白表达情况。第二部分离体细胞实验：(1)贴壁法原代培养PASMCs，0【．SMA抗体免疫荧光技术鉴定原代培养的PAS

9、MCs；(2)为验证PASMCs增殖对低氧时间依赖性，本研究选择不同时间段将PASMCs放在低氧培养箱中进行低氧(氧浓度2．5％)干预，分别于常氧及低氧条件下培养6h、12h、24h、48h，MTT法检测细胞增殖，并使用WB技术检测低氧Oh、6h、12h、24h、48h后PlASMCsM丘也及PCNA蛋白表达情况；(4)经以上实验筛选出PASMCs增殖最佳时间点作为后续实验低氧时间，低氧条件下使用LY294002(P13K抑制剂)、LipofectaminelM2000转染携带pEGFPMf}也