大黄酸及大黄素对大鼠腹腔巨噬细胞p2x,7通道的影响

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1、南开大学硕士学位论文大黄酸及大黄素对大鼠腹腔巨噬细胞P2X<,7>通道的影响姓名：邹洁申请学位级别：硕士专业：生物物理学指导教师：李俊英20090501摘要近年来，细胞膜上的离子通道越来越受到大家的关注。其中，许多离子通道在病理学方面起了十分关键的作用，许多“离子通道病”被相继发现。由此，一些离子通道已经成为了药物研发的靶点。P2X7受体是一种ATP门控的离子通道，主要在免疫细胞中表达，参与多种免疫反应过程，并可诱发细胞凋亡和坏死。本文以大鼠腹腔巨噬细胞(PMQ)为研究对象，首先研究了中药大黄的有效成分大黄酸(Rhein)和大黄素(Emodin)对胞外高浓度的三磷酸腺苷(ATP)引起的细胞

2、死亡的影响，然后进一步研究了两种药物对P2X，受体的作用，探讨了药物的作用机制。本实验利用MTT法检测巨噬细胞死亡。结果表明，胞外高浓度ATP作用30min可诱导巨噬细胞死亡，且呈剂量依赖性，其中5mMATP诱导死亡率可达36．3％。而这一现象可以被大黄酸和大黄素所抑制，并且呈现浓度依赖性，其半数抑制浓度(IC50)分别为：0．651xM和o．se心,l。为了探讨这一现象的机理，本实验又利用单细胞钙离子成像分析系统，检测了大黄酸和大黄素对ATP引起的巨噬细胞【ca2+】i动力学变化的抑制作用。同时，本实验用P2X7受体的特异性激动剂BzATP代替ATP做了相同的实验。结果显示，5mMATP

3、和50山VmzATP均能诱发正常巨噬细胞[ca2+】i迅速升高；且大黄酸和大黄素X寸[Ca2qj的升高有明显抑制作用，并且具有剂量依赖性。本实验还利用了P2X7受体的特异性，用倒置荧光显微镜检测了巨噬细胞对溴化乙锭(EB)摄取程度。发现5mMATP刺激10min能显著增加巨噬细胞对EB的摄取，即增加了巨噬细胞细胞膜的通透性。并且大黄酸和大黄素可以剂量依赖性的抑制细胞膜通透性的增强。以上结果说明，大黄酸和大黄素可以剂量依赖性抑制胞外高浓度ATP引起的巨噬细胞死亡，并且这一抑制作用是由于二者抑制了细胞膜上的P2X7受体所致。本研究在一定程度上解释了大黄素和大黄算调节免疫的药物作用机理，为药物的

4、研发提供了基础。关键词：巨噬细胞三磷酸腺苷大黄酸大黄素P2X7受体胞内自由钙离子浓度AbstractTheaimofthisstudyistoinvestigatetheeffectsofemodinandrhein,compoundsextractedfronChineseherbdahuang，onATP-inducedceildeath，increasein【C一]i，andpermeabilizationofratperitonealmacrophage．CelldeathwasdeterminedbyMTTmethod．thekineticsofintracellularfree

5、C一+concentration(【c一]i)inasinglecellweremonitoredcontinuouslybyconfocallaserscanningmicroscope，andtheplasmamembranepermeabilitywasdemonstratedbyconfocalmicroscope．Thedatashowed，5mMextracellularATP(ATPo，excitomotorofP2x7receptorexpressedonthesurfaceofPM9)triggeredthedeathofPM叩，at36．3％．Thesephenomen

6、aweredose—dependentlyinhibitedbyrheinandemodinwhosehalf-inhibitingconcentration(IC50value)were0．65p．Mand0．52}tMrespectively．5mMATPoalsocouldcauseasharppeak，andthenaplateau,of【C一+】iinPM‘p．Thesephenomenawerealsodose-dependentlyinhibitedbyrheinandemodin,at0．43I．tMand0．30州astheirIC50valuerespectively．

7、InsteadofATP,weused50州BzATP,thespecialistapoptosisofP2X7receptortostimulatePMo．Wecouldseeastheresultthatthereisalsoarapidjumpingbutnoobviousdescending，onlyaplateausustainfollowing．Boththejumpingandtheplateauarein