l-谷氨酰胺生产菌的定向改造

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1、万方数据分类号：TQ922密级：(秘密机密绝密)学校代码：10057研究生学号：11809002L．谷氨酰胺生产菌的定向改造RationalEngineeringofL—glutamineProducingStrain专业名称：发酵工程指导教师姓名：陈宁教授研究生姓名：江衍哲申请学位级别：工学硕士论文提交日期：2014年6月论文课题来源：国家高技术研究发展计划“863计划”(2013AAl02106)学位授予单位：天津科技大学万方数据天津科技大学学位论文原创性声明IUlllUlIIIIIIUIY2755139本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究工作所取得的成果

2、。除文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包括任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果内容，也不包括为获得天津科技大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。对本文研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。作者签名：诅々娟絮日期：加J午年多月／D日知识产权和专利权保护声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师具体指导下并得到相关研究经费支持下完成的，其数据和研究成果归属于导师和作者本人，知识产权单位属天津科技大学；所涉及的创造性发明的专利权及使用权完全归天津科技大学所有。本人保证毕业后，以本论文数据和资料发表论文或使用论文工作

3、成果时署名第一单位仍然为天津科技大学。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。作者签名：蚴骛日期：掷年‘月力日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，同意公布论文的全部或部分内容，允许论文被查阅和借阅。本人授权天津科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密II(请在方框内打“妒)，在年解密后适用本授权书。本学位论文属于，不保密&到(请在方框内打“√”)。作者签名：江钥鸟日期：纠p年‘月f。日导师签名：印

4、厉乓日期：阳睁年石月勿日Lj万方数据摘要L．谷氨酰胺在生命活动中具有重要作用，已被广泛应用于食品、医药等诸多领域。随着市场需求的不断增大，提高谷氨酰胺的生产效率显得至关重要，而代谢途径的优化可能对生产效率的提高起到非常重要的作用。本文以L．谷氨酰胺生产菌CorynebacteriumglutamicumGM34为出发菌，以提高谷氨酰胺的产量、减少副产物谷氨酸产量和构建温敏型谷氨酰胺生产菌为目标，对CglutamicumGM34进行了一系列分子改造。主要研究内容和结果如下：(1)NCgll221基因编码的蛋自是重要的谷氨酸分泌载体，为了研究NCgll221基因缺失对副产物谷氨酸积累的

5、影响，采用同源重组技术敲除了谷氨酰胺生产菌GM34的NC911221基因，构建了菌株GM34ANCgll221。在5L发酵罐上进行了分批补料发酵实验，结果菌株GM34△NCgll221的谷氨酸积累量为0．17(g／gDCW)，比出发菌降低了19．1％，而谷氨酰胺的积累量未见明显变化。(2)丙酮酸羧化酶(pyruvatecarboxylase，Pc，由pyc基因编码)在谷氨酸棒杆菌的回补途径中有重要作用。利用穿梭质粒pXMJl9构建了pyc基因过表达菌株GM34pXMJl9pyc。5L发酵罐分批补料发酵实验结果表明，过表达pyc基因使菌体生长速度得到了提升，谷氨酰胺产量为3．3(g／

6、gDCW)，比对照组提高了5．5％。(3)温度敏感突变株相比现有的生物素缺陷菌株具有非常多的优点。ltsA基因的突变可以使某些谷氨酸棒杆菌菌株转变为温度敏感菌株。利用整合载体pKl8mobsacB，通过同源重组技术敲除了谷氨酰胺生产菌GM34的ltsA基因，构建了菌株GM34△ltsA。培养发现GM34AltsA38℃下仍能生长。在5L发酵罐上进行发酵实验，发现温度转换不能诱导L．谷氨酰胺分泌。说明ltsA基因缺失不能使GM34转变为温度敏感突变株，这为以后的进一步改造提供了一定的借鉴。(4)PH控制对谷氨酰胺发酵有重要影响。发酵20h左右，发酵液中谷氨酸含量不再增加，而谷氨酸是谷

7、氨酰胺的直接前体物，推测此时谷氨酸的生成已经不能满足谷氨酰胺合成的需要。为了加强前体物的合成速度，研究此时分别调整pH提升至5．8、6．0和6．2对谷氨酰胺发酵的影响。发酵结果表明，在pH5．8和6．0时副产物谷氨酸含量不会增加，谷氨酰胺产量分别为54．3∥L和57．2gm，pH6．2时副产物谷氨酸积累量升至12．4g／L，谷氨酰胺产量为50．6g／L。关键词：谷氨酸棒杆菌；L一谷氨酰胺；定向改造；L．谷氨酸；丙酮酸羧化酶万方数据ABSTRACTL—glutamine