长牡蛎(crassostrea gigas)纤维素酶相关基因的克隆和表达分析

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1、中国海洋大学硕士学位论文长牡蛎（Crassostreagigas）纤维素酶相关基因的克隆和表达分析姓名：刘昌海申请学位级别：硕士专业：水产养殖指导教师：李琪20120601长牡蛎纤维素酶相关基因的克隆和表达分析长牡蛎(D伽Ds护P口g和s)纤维素酶相关基因的克隆和表达分析摘要纤维素是葡萄糖分子通过p．1，4．糖苷键连接形成的生物大分子。是植物细胞壁的主要组成成份，是世界上含量最丰富的生物资源。纤维素的降解主要是依靠纤维素酶的作用。纤维素酶主要由以下三种酶组成：内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和B一葡萄糖苷酶。纤维素首先在内切葡聚糖酶和外切葡

2、聚糖酶的作用下被切断p．1，4．糖苷键形成纤维素糊精或者纤维二糖，然后在p．葡萄糖苷酶的作用下将纤维素糊精或者纤维二糖降解为葡萄糖。生物降解纤维素是各种酶的协同和逐步的反应，每种酶在纤维素的降解中都发挥着重要的作用。之前，一直认为只有微生物例如细菌和真菌能够降解和利用纤维素作为碳源。而高等动物是不能利用纤维素的，但是一些食草动物例外，例如反刍动物，它们利用纤维素是因为体内与之共生的微生物的作用。一直认为白蚁能够消化纤维素是依靠体内的共生菌，然而最新的研究发现，白蚁体内存在内源性的纤维素酶。这以发现也说明了不仅仅是微生物能够降解纤维素。

3、之后，内源性的纤维素酶基因在许多昆虫和无脊椎动物中被发现。最近，在软体动物门中，也报道存在内源性的纤维素酶。并且已经在紫贻贝(坳玎埘P砌凰)、皱纹盘鲍(觑lZfD协d缸c淞^口刀玎日f)、福寿螺(爿聊，甜f7口，．砌仃∞sP口")、日本河蚬(CD而记”肠御D”f阳)体内发现了p-葡萄糖苷酶基因。但是还没有报道在长牡蛎体内存在纤维素消化酶。本实验通过同源克隆和cDNA末端快速扩增技术(RACE)成功地从长牡蛎体内克隆了内切葡聚糖酶基因和p一葡萄糖苷酶基因，并对基因的结构和表达特性进行了分析。1．长牡蛎内切葡聚糖酶基因的克隆和表达分析内切

4、葡聚糖酶cDNA全长802bp，开放阅读框架630bp，编码209个氨基酸。基因组DNA全长5056bp，含有两段内含子长度分别为2053bp和2313bp。cDNA具有与已发现的内切葡聚糖酶基因相同的保守区结构和功能域，并且与其他已知贝类的内切葡聚糖酶有较高的同源性，含有糖基水解酶第45家族的保守结构长牡蛎纤维素酶相关基因的竟隆和表达分析域。利用RT．PCR方法研究了该基因在长牡蛎消化腺、外套膜、鳃、肌肉、性腺和唇瓣组织中的表达，发_聃切葡聚糖酶基因只在消化腺中表达，而在其他组织中没有表达。2．长牡蛎B．葡萄糖苷酶基因的克隆和表达分

5、析B．葡萄糖苷酶cDNA全长2052bp，开放阅读框架1347bp，编码448个氨基酸。cDNA具有与已发现的p．葡萄糖苷酶基因相同的保守区结构和功能域，并含有糖基水解酶第一家族(GHF．1)的保守区间。利用IH．PCR方法研究了该基因在长牡蛎消化腺、外套膜、鳃、肌肉、性腺和唇瓣组织中的表达，发现B一葡萄糖苷酶也仅在消化腺中表达，而在其他组织中不存在表达。关键词：纤维素酶；内切葡聚糖酶；D-葡萄糖苷酶；长牡蛎；基因克隆；表达分析。长牡蛎纤维素酶相关基因的克隆和表达分析CloⅡing，characterizationandexpress

6、ionanalysis0fc6UulosegeneinAbs仃actCelluloseisapolysaccharidecomposedofglucopy砌osylu11itsjoinedby1，4。glycosidicbonds；itisamajorcomponentofplalltcellwallaIldt11usmoStabulldantbiomassresourceontlleEartll．Cellulosecanbebiode伊adedbycellulosede铲adiIlgem=)，Inmescalled‘‘cellula

7、se”．ThecellulaSeref．ersto3enzymes，n锄ely，endo．p一1，4。舀uc锄aSe(EC3．2．1．4)，cellobiohydrolaSe(EC3．2．1．91)andp一舀ucosidase(EC3．2．1．21)．Firstly，longcellulosechainwaScleaVesatthep一1，4一liIll【ageby锄do-p一1，4-glucallasea11dcellobiohydrolaSe，producingcellodextrinorcellobiose．Then，tlle

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