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1、利用SSR分子标记鉴定杂交稻种子齐两优918纯度摘要：种子纯度是杂交水稻种子质量的核心指标。微卫星技术（SSR分子标记技术）因其具有稳定性好、准确可靠、易于操作等优点在种子纯度鉴定中得到了越来越广泛的应用。采用48个SSR分子标记对杂交水稻组合齐两优918的双亲及F1之间的多态性进行筛选和纯度检测技术研究，为种子生产以及种子上市销售做好质量监督，杜绝质量风险。经过筛选得到如下结果：在对48对引物进行筛选后，发现有5对引物在双亲间显示稳定多态性，在杂种F1上表现为父母本共显性条带，表明该5对引物适宜于齐两优918杂交种子纯度鉴定，可用于种子质量
2、监控。关键词：杂交水稻；种子纯度鉴定；微卫星分子标记（SSR分子标记）中图分类号S511文献标识码A文章编号1007-7731（2013）17-120-02种子纯度是杂交水稻种子质量的核心指标，是种子质量分级的主要标准，是企业购销种子的关键依据，历来受到种子管理部门、种子企业和农民的密切关注。而无论三系还是两系杂交稻，高纯度杂交种都是发挥杂种优势增产潜力的基础，种子纯度不够会给种植户造成减产和巨大的经济损失。品种纯度检验的方法很多，根据其所依据的原理不同主要分为形态鉴定、物理化学法鉴定、生理生化法鉴定、分子生物学方法鉴定、细胞学方法鉴定。其中
3、分子测定技术又分为RFLP、AFLP、RAPD、SSR分子检测技术。而SSR(SimpleSequenceRepeats,简单重复序列)分子技术是近年来发展起来的一种以特异引物PCR为基础的分子标记技术，也称为微卫星DNA(MicrosatelliteDNA)技术，其SSR标记是一类由几个核昔酸(一般为1〜6个)为重复单位组成的长达几十个核昔酸的串联重复序列，具有以下优点：(1)数量丰富，覆盖了整个基因组，揭不的多态性高；(2)具有多等位基因的特性，提供的信息量高；(3)以孟德尔方式进行遗传,呈共显性；(4)每个位点由设计的引物顺序决定，便于
4、不同的实验室之间相互交流合作开发特异性引物。因而SSR分子检测技术在种子纯度鉴定中得到了广泛应用。笔者利用SSR分子检测技术，对齐两优918母本033S和父本R918进行扩增反应和电泳图谱的分析，结果选出了5对引物，这5对引物对齐两优918的母本033S和父本R918都显示出了很好的多态性，并在齐两优918±显示出共显性特征，因此适宜于对其进行纯度鉴定以及质量监控。1材料与方法1.1实验材料水稻种子齐两优918的不育系033S在光照培养箱(恒温30°C)中培养生长7d的幼苗；恢复系R918在光照培养箱（恒温30°C）中培养生长7d的幼苗；杂交
5、种（F1）齐两优918在光照培养箱（恒温30°C）中培养生长7d的幼苗。1.2实验方法1.2.1DNA的提取DNA的提取采用CTAB法：取一棵幼苗，用剪刀剪碎后放在2.0mL的离心管中，加入液氮，研至粉状即可，然后在离心管中加入60011L的裂解液，把离心管盖好放在65°C的水浴锅里预热30min,期间要每隔lOmin反复颠倒几次。预热后加入氯仿：异戊醇抽提液600pL,把离心管盖好放入低温髙速冷冻离心机中以13000r/min离心15〜20min,然后把上清液转移到1.5mL的离心管中，加入1/10体积的醋酸钠和2倍体积的无水乙醇，再放入离
6、心机中以13000r/min离心5min,倒出上清液，这时在底部就可以看到白色透明沉淀。再加入500uL的70%乙醇，离心2min,开盖后将底部白色沉淀风干即可，加入100yL的TE缓冲溶液，-2（rc保存备用。1.2.2PCR反应PCR反应体系为:10XBuffer倍液，dNTP0.12mmol/L,Mg2+1.5mmol/L,每种引物1Umol/L,0.2单位Taq酶，10ng的DNA,不足10uL的部分用超纯水补足（共计10uL）oPCR反应程序为：95°C预变性5min,然后94°Clmin,56°C30s,72°C30s,进行35个
7、循环，再在72°C延伸7mino最后冷却至re。1.2.3聚丙烯酰胺凝胶电泳把电泳槽装好后在底部用1%的琼脂凝胶封底，用聚丙烯酰胺凝胶溶液（8%的聚丙烯酰胺溶液+0.5%体积的10%过硫酸铁溶液+0.1%的TEMED）灌胶,快速插入梳子。在PCR扩增反应产物中加入澳酚蓝指示剂，待胶凝固后进行点样。按正负极接通电泳仪后，180〜200V的电压下跑电泳2.5h左右。将胶放入固定液（体积比0.5%乙酸和体积比10%的乙醇）中固定12min,然后倒去固定液,用染色液（AgN03溶液）染色12min,倒去染色液，用纯水漂洗2次，每次1〜2mino最后将
8、凝胶放入显色液（体积比0.4%的甲醛溶液和质量体积比1.5%的NaOH溶液）中直至条带出现，并拍照记录。2结果与分析齐两优918及其亲本用48对引物进行筛（下转12
