盐酸小檗碱通过sortasea和esp途径影响粪肠球菌生物被膜的初步探讨

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1、分类号UDC密级编号十韵大学CENTRALSOUTHUNIVERSITY硕士学位论文论文题目：盐酸小檗碱通过SortaseA和Esp途径影响粪肠球菌生物被膜的初步探讨学科、专业：研究生：临床检验诊断学i-倩倩量肾氅童黑苎伍勇教授专业技术职称：～刀'～“中南大学二。一二年五月分类号UDC硕士学位论文

2、IUlIIIIIIIIIIUIIIIJIIIY2199078密级。．：二■一盐酸小檗碱通过SortaseA和Esp途径影响粪肠球菌生物被膜的初步探讨。．．．Preliminarystudy+ontheeffectsofBerberineh

3、ydrochlorideontheEnterococcusfeacailsbiofilmthroughthepathwayofSortaseAandEsp作者姓名：学科专业：学院(系、所)：指导教师：论文答辩日期丝!兰：￡：哆卜倩倩临床检验诊断学中南大学湘雅三医院伍勇答辩委员会主席—逮中南大学2012年5月原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用

4、过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。作者签名：埘学位论文版权使用授权书本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。作者签名：导师签名日期旦年二月丛日硕士学位论文摘要1．粪肠球菌生物被膜形成的动态观察及早期相关基因的

5、表达研究目的：建立粪肠球菌生物被膜(biofilm，BF)体外模型，观察生物被膜形成发展过程中空间立体结构上的动态变化；探讨sortaseA(转肽酶A编码基因)基因、esp(肠球菌表面蛋白)与粪肠球菌生物被膜形成早期的相关性，以利于临床寻找药物靶点，提高用药效率。方法：(1)临床筛选并鉴定尿路感染相关性粪肠球菌生物被膜菌，分为生物被膜菌组及生物被膜阴性组，结晶紫染色法定量检测生物被膜且里0(2)采用玻片法体外建立粪肠球菌生物被膜模型，分别培养1、8、16、24、48及72h，利用激光共聚焦扫描显微镜(CLSM)及荧光显微镜动态观察生

6、物被膜形成发展过程中的空间结构变化。(3)利用实时定量PCR方法相对定量检测esp、sortaseA在生物被膜早期菌和生物被膜阴性菌中的表达差异，做统计学分析。结果：(1)本院99例尿路感染患者导尿管中共筛选出生物被膜菌36株，阳性率36．4％。其中粪肠球菌占生物被膜菌的27．8％。(2)结晶紫染色定量显示菌株在1、8、16h生物被膜逐渐形成，24h趋于顶峰，随后生物被膜量回落，48h有减少，72h进一步减少。(3)菌株培养在16小时基本形成，24小时成熟，48小时有播散。随着生物被膜形成过程的进展，死菌量及活菌量逐渐增多，到48h

7、开始有所减少；细菌总量由粘附面到游离面逐渐减少；中间层活菌量密度最高。(4)sortaseA、esp基因的表达与粪肠球生物被膜菌形成早期具有相关性。生物被膜早期菌组sortaseA、esp表达量分别是生物被膜阴性菌组的7．9与13．5倍。小结：(1)本研究细菌尿路感染中，生物被膜菌检出率为36．3％．其中以硕士学位论文粪肠球菌所占生物被膜菌比例最大(27．8％)。这一结果与我们实验室三年前研究的结论基本一致，提示本院在近三年留置导尿管相关的尿路感染生物被膜菌分布变化不明显。(2)利用荧光显微镜及CLSM观察，证实了粪肠球菌BF形成和

8、发展经历了最初的定植及不可逆黏附等早期阶段、结构分化阶段、发展成熟阶段、和解聚再定植阶段。细菌总量由粘附面到游离面逐渐减少；中间层活菌量密度较高。(3)sortaseA、esp基因与粪肠球生物被膜菌形成早期密切相关，在生物被膜形成早期上调。2．盐酸小檗碱对粪肠球菌生物被膜形成的影响目的：研究盐酸小檗碱对粪肠球菌生物被膜形成的影响，并探讨其作用机制。方法：以生物被膜量较强的菌株EF06为研究对象，将盐酸小檗碱处理菌株EF06的不同分为两组，甲组为不同浓度盐酸小檗碱与EF06共同孵育24h；乙组为EF06培养24h后与不同浓度盐酸小檗碱

9、再共培24h。荧光显微镜观察药物未处理组和处理组之间的差异。结晶紫染色法定量检测不同处理组内生物被膜形成量和生物被膜量的差异，做统计学分析。结果：(1)荧光显微镜检测，甲处理组中盐酸小檗碱作用浓度在20Pg／ml和40№／ml时，EF