鸡新城疫病毒hn09-69株主要基因的克隆、原核表达及鉴定

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1、河南农业大学硕士学位论文鸡新城疫病毒HN09--69株主要基因的克隆、原核表达及鉴定姓名：陈礼朋申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：李新生201206摘要新城疫(Newcastledisease．ND)是由新城疫病毒(Newcastlediseasevirus，NDV)2J[起禽的高度接触性传染病，主要引起呼吸道，神经系统或肠道病变。NDV是单股负链的RNA病毒，为副黏病毒科副黏病毒亚科禽腮腺炎病毒属中的一个成员，基因组编码NP、P、M、F、HN、L6种主要结构蛋白。另外，P基因可以通过“RNA编辑”方式编码产生额外的两个非结构蛋白—-V蛋白和W蛋白。从19

2、26年发现该病以来，NDV传播到世界各个国家和地区，并对世界养禽业及国际贸易造成巨大的经济损失。2009年本实验室从中牟某发病鸡场采集病料，并经病毒分离、鉴定和致病性实验，证明病原为强毒NDV，并命名为HN09．69株。本试验以HN09．69分离株为研究对象，对主要基因分别进行了克隆、原核表达及鉴定。首先根据GenBank录入的NDV的各基因组序列设计5对引物，运用RT．PCR技术从HN09-69分离株的基因组中分别扩增出NP、P、M、F、HN基因的全长ORF序列并测序。对NP、P、M、F、HN基因核苷酸同源性进行比较、序列和进化分析，得出HN09-69株与传统疫苗

3、株LaSofa、Clone．30、VG／GA、F48E8、Mukteswar同源性较低，而与水禽分离株FPI一02、SD09、SF02、SDWF02、ZJl同源性较高，均在96％以上，并与两鸭源分离株SD09、SF02在同一进化分支上，从基因分型上得出HN09．69株属于当前流行的Vlld型。对各基因进行基于氨基酸序列的生物信息学分析，表明F、HN存在信号肽和跨膜区。其次，分别以构建的克隆质粒为模板，用上下游分别含BamHl、Xhol位点的引物，亚克隆NP、P、V基因的ORF及M(I．798bp)、F(1119一1506bp)、HN(675．1l16bp)基因片段插

4、入到原核表达载体pET-28a(+)@，成功构建了重组原核表达质粒。将鉴定正确的原核表达质粒分别转化BL21(DE3)宿主菌，经IPTG诱导表达，SDS．PAGE电泳结果表明，各重组质粒在BL21(DE3)菌中获得了高效表达，分别在相应位置上出现明显的目的蛋白条带，且NP、P蛋白以可溶性蛋白形式表达，M、F、HN、V蛋白以包涵体蛋白形式表达。然后对各蛋白表达的条件进行优化，并对蛋白进行Western．blot鉴定。用Ni亲和层析柱对NP、P进行大量纯化，后与适量的佐剂混合乳化，做成疫苗，免疫42日龄SPF鸡(300pg／只)。二免后第7天开始采血，并每隔7天采血一次

5、，第21天用F48E8株进行攻毒，观察结果LaSota免疫组的保护率为100％，NP蛋白免疫组和对照组保护率为0，P蛋白免疫组保护率为20％。综上所述，本研究成功克隆了HN09．69株主要基因，构建了原核表达质粒，并实现了其在宿主菌中的高效表达。纯化了NP、P融合蛋白，并进行SPF鸡免疫保护实验，为进一步研究各蛋白的免疫原性和亚单位疫苗奠定基础。关键词：新城疫病毒，克隆，原核表达，融合蛋白，蛋白纯化英文摘要CLoNINGJ州ALySIS．PRoKARYoTICEXPRESSIONANDIDENTⅡrYoFMAJORGENEoFNEWCASTLEDISEASEVIRU

6、SHN09．69STRAINSupervisor：LixinshengMaster(Ph．D)Candidate：ChenLiPengAnSTRACT：Newcastlediseasevirus(NDV)isamemberofthefamilyParamyxoviridae，andhasbeenassignedtothegenusAvulaviruSinthesubfamilyPararnyxovirinae．Itcausesahighlycontagiousrespiratory，neurological，orentericdiseaseinchickens。Th

7、egenomewasalsoobservedtobetypicalofBaltimoregroupV-singlestrandedRNAofnegativesense．itsgenomeencodesixproteinsNP、P、M、F、FINandL．TwoadditionalproteinsVandWareexpressedbymRNAswhicharederivedfromthePgeneviaRNAediting．From1926yearssinceitsdiscovery,NDVspreadtothecountriesandregionsinthewo