含活基质细胞的去上皮羊膜促进角膜上皮干细胞特性的维持和扩增

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1、厦门大学硕士学位论文含活基质细胞的去上皮羊膜促进角膜上皮干细胞特性的维持和扩增姓名：杨洁申请学位级别：硕士专业：肿瘤学指导教师：李炜201205摘要角膜上皮干细胞存在于角膜缘基底部，严重眼表面疾病常导致角膜上皮干细胞缺乏，造成患者严重视功能障碍甚至失明。角膜上皮干细胞体外扩增和移植是目前治疗严重角膜上皮干细胞缺乏的有效方法。理想的角膜上皮干细胞体外扩增技术是在体外模拟角膜上皮干细胞所处的微环境，以保持干细胞的特性并促进干细胞的增殖。迄今已有不同技术用于体外扩增角膜上皮干细胞，包括采用不同的载体，经过不同处理的供体细胞，以及不同

2、的培养基等。到目前为止还没有建立一个标准化的角膜上皮干细胞体外扩增技术。目的：羊膜作为一种载体，已经广泛应用于角膜上皮干细胞的体外扩增。一般认为，在体外，它可能作为一种干细胞的替代微环境。先前的研究使用有或无上皮的冷冻保存羊膜作为载体，其中不含羊膜来源的活细胞。本研究拟探讨含活细胞的羊膜基质是否可以发挥微环境作用，以促进角膜上皮干细胞的体外扩增。方法：新鲜羊膜组织经过DispaseII37℃短暂消化后刮除上皮细胞，固定于insert环上，一部分羊膜于．80℃反复冻融至少三次使基质细胞死亡作为对照组(D．山～M)，另外一部分羊膜

3、未作任何处理放入SHEM培养基中为实验组(L．dAM)。从经DispaseII消化过的兔角膜缘组织块上分离兔角膜缘上皮细胞片，并转移到去上皮羊膜基质上培养大约7天。一部分组织块在培养前行Brdu标记，并示踪培养7天，一部分培养3天后进行标记且不行示踪培养。收集扩增的上皮细胞以3T3细胞为滋养层进行克隆培养。在羊膜表面扩增的细胞分别行K12，K14，p63，飚67的wh01e．mount和切片染色，以及Ⅳ型胶原、VH型胶原的切片免疫荧光染色。同时，收集上皮细胞，用蛋白印迹法检测K12，K14，p63，鼬67的表达。在不用任何消化

4、处理情况下，用刮刀刮取L．dAM和D一也～M上扩增的上皮片，以备移植。结果：在L．也～M上培养的上皮细胞排列更紧密，形态更小且均一。L．dAM组上皮细胞的克隆形成率明显比D．也蝴组高。示踪7天的BrdU标记保留细胞在L．也州组明显比D．dAM多，而不示踪的BrdU标记细胞D．山蝴稍多，但两组区别没有统计学意义。免疫荧光染色及Wbstemblot均显示L．dAM组的p63摘要和酗67表达明显比D．dAM多，K12在L．dAM组主要在浅层上皮细胞表达，基底层不表达，D．也蝴组细胞层较少，全层表达K12，蛋白印迹法结果显示D．dAM

5、组K12表达较多；K14切片染色D一幽心订组全层表达，L广dAM组表达较弱，但蛋白印迹法显示K14在L广山蝴组比D．山蝴组稍多。在【广dAM上培养的上皮扩增后较易分离成完整的上皮片，可供移植，而D．出蝴组的上皮刮取时易分散，不能成完整的细胞片。培养7天后的两组上皮都有Ⅳ型胶原的表达，在培养14天后的L．也蝴组上皮刮片中也有完整的表达。结论：含有活基质细胞的羊膜促进角膜缘干细胞体外扩增及其干细胞特性的维持。羊膜基质细胞在角膜上皮组织工程中可能发挥微环境(Iliche)细胞的作用。关键词：羊膜、角膜上皮干细胞、基质细胞、微环境ⅡA

6、bstractBackground：ComealepiⅡlelialstemcellsarelocatedinthelirnbalbasalregioIl's0-calledlimbal印ithelialstemcells(LESCs)．ManyseVereocularsurfacediseasescancauselinlbalstemceUdeficiency(LSCD)，whichmayleadtoseriousVisualdisorderor吖eIlloss．Atpresent，themoSte行ectivesoIuti

7、oniIlthe仃canIlentofLSCDisLESCsexViVoexp肌sionand仃a11splantation．111eidealexViV0eXpansiontechniqueistoiIIlitatetheLESCsIlicheortheirmicroellViro彻[1entinVitr0，wllichhelpsmaintaillttIestemnessofLESCs锄dpromoteLESCsprolifefation．TiUnow，nmnerousexViVoeXpaIlsionmethodshaVeb

8、eendeVeloped，iIlcludiIlgusingdi仃．eremcarTiersormedium，ormedonorLESCsaRerdi仃打enttrea廿nent，however’thereisnostandamizedLESCsexⅥVoeXpaIlSionp