磁刺激对小鼠原代海马神经元突触可塑性相关蛋白和钙信号转导机制影响的研究

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1、河北医科大学博士学位论文磁刺激对小鼠原代海马神经元突触可塑性相关蛋白和钙信号转导机制影响的研究姓名：张展翅申请学位级别：博士专业：人体解剖与组织胚胎学指导教师：崔慧先201204中文摘要磁刺激对小鼠原代海马神经元突触可塑性相关蛋白和钙信号转导机制影响的研究摘要海马是中枢神经系统的重要脑区，与学习、记忆等生理功能有着密切的关系，许多神经系统的退行性疾病如阿尔茨海默病、癫痫等也与该部位的病变有关。重复经颅磁刺激(Repetitivetranscranialmagneticstimulation，rTMS)是在TMS基础上发展起来的新的神经电生理技术，通过

2、脉冲磁场产生感应电流，激活神经元，通过暂时改变被刺激组织的兴奋性而发挥治疗作用。研究表明rTMS已成功用于阿尔茨海默病、癫痫、抑郁症等疾病的治疗。前期研究认为老化相关的认知功能下降可能和神经元的丢失有关，但越来越多的证据证实，在正常老化过程中，神经元的数量并没有发生明显的变化，而是神经元间信息传递的特化结构一突触的数量及完整性发生了改变，出现不同程度的下降。突触在其结构以及功能方面的修饰称为突触可塑性，是学习记忆的基础。研究突触可塑性与神经系统发育、脑缺血损伤后修复以及学习记忆等功能密切相关，已成为近年来研究的热点。研究发现恒磁场作用能促进培养神经元

3、突起的生长，应用磁刺激(magneticstimulation，MS)干预对数生长期的PCI2细胞后使细胞突起生长明显增多，多巴胺分泌增加。动物实验同样证实MS能增加血管痴呆大鼠海马CAI区及MPTP诱导的帕金森大鼠纹状体突触素的表达，提示MS具有促进突触重塑的功能。但近年来关于MS的研究大多集中在它对病理状态下突触重塑与再生的影响，而关于MS对正常脑发育、神经网络构建等影响的研究较少，MS对突触可塑性的调节作用涉及到细胞内众多分子通路，内在机制复杂，．目前对MS干预体外培养的神经元的内在机制尚缺乏深入系统的研究。海马神经元原代培养比那些在体外经过多

4、次传代的神经细胞株更能代表体内神经细胞正常的发育状态，是研究神经细胞生长、发育的理想模型。因此我们选取原代培养的海马神经元，施以不同强度的刺激参数，通过观察MS对海马神经元突触超微结构的影响、突触可塑性相关蛋白、胞浆内钙离子浓度、NR2B、pCaMKII、pCREB等的表达变化，中文摘要探讨磁刺激对正常培养的海马神经元突起生长及突触可塑性相关蛋白的调节作用。并通过对钙信号转导通路干预作用的研究，明确MS发挥作用的确切机制，为临床进一步研究MS对正常脑可塑性的影响提供理论基础。第一部分重复磁刺激对原代海马神经元突起生长和c．10s激活作用的研究目的：探

5、讨磁刺激是否能够引起原代海马神经元c．fos的表达，促进神经元突起生长、并观察磁刺激对海马神经元存活率的影响。方法：将原代培养的海马神经元随机分为对照组(正常培养无任何干预)；假刺激组(置于相同磁场环境但不接受磁刺激)；30％最大刺激强度组(约1．11T刺激强度作用于细胞)；40％最大刺激强度组(约1．48T刺激强度作用于细胞)。培养24h的神经元换液后开始接受磁刺激。刺激频率为1Hz，每天刺激3组，每组20个序列，每个序列间隔lS，每组间隔1min，每天固定时间刺激，连续刺激5d，磁头距离细胞1cm。培养第7d进行MAP2免疫荧光显色，观察磁刺激对

6、海马神经元突起数目和突起生长长度的影响，并通过免疫荧光显色和免疫印迹法检测各组海马神经元c．fos的表达。应用MTT微量比色法观察磁刺激对海马神经元存活率的影响。结果：原代培养的海马神经元经MAP2染色鉴定纯度大于90％，可用于实验。2个刺激强度组多突起神经元(脱、咒>3)占总神经元的比例以及神经元突起长度明显高于对照组(氏O．05)，且30％强度组的比例高于40％强度组，差异有统计学意义伙O．05)。假刺激组和对照组间无明显差异(尸>O．05)。C．fos免疫荧光显色结果显示两个刺激强度组c．fos阳性神经元比例明显高于对照组、假刺激组(尸

7、1)，而对照组、假刺激组间阳性神经元比例无差异pO．05)。免疫印迹结果显示c．fos蛋白表达仅30％强度组表达量增高有统计学意义(P

8、元c．10s蛋白的表达，并且对神经元存活率无有害影响，而40％强度(1．48T)组c．fos蛋白无明显变化，